10月17日，信念医药与武田中国宣布达成独家合作协议，信念医药授权武田中国在中国内地、中国香港和中国澳门负责其在研产品BBM-H901注射液的商业化经营。BBM-H901注射液以静脉给药的方式将人凝血因子Ⅸ基因导入B型血友病患者体内持续表达，提高并长期维持患者的凝血因子水平，用于预防B型血友病成年患者出血。该产品是国内首个获批进入注册临床试验的B型血友病的AAV基因治疗药物，目前已经顺利完成Ⅲ期注册临床试验的受试者给药。

体内基因治疗正迅速成为单基因疾病的一种新的治疗方式。近三十年来，研究人员一直在探索血友病A（Hemophilia A，HA）和血友病B（Hemophilia B，HB）基因治疗的临床潜力。随着用于治疗HA的基因治疗产品Roctavian（valoctocogene roxaparvovec）和用于治疗HB的基因治疗产品Hemgenix(etranacogene dezaparvovec)的相继上市，越来越多的血友病基因治疗临床研究取得可喜进展，以及监管部门对血友病中AAV载体使用的支持，AAV基因治疗在血友病研究方向的努力将取得更多积极成果。

近期，来自美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Benjamin J. Samelson-Jones等研究人员在Annual Review of Medicine期刊发表了题为“Adeno-associated Virus Gene Therapy for Hemophilia”的综述，回顾了HA和HB的AAV基因治疗的临床进展，并探讨了近期在血友病和其他单基因疾病的AAV临床试验中出现的突出问题。

1. 当前临床发展中的血友病基因治疗策略

对于重度血友病患者，基因治疗提供了一种理想的预防方案，在该方案中，通过单次给药，使凝血因子基因在患者体内长期稳定表达。尽管在过去的三十年里已经研究了多种血友病的基因治疗策略，但最先进的策略是靶向肝细胞的系统性给药，输注重组腺相关病毒(AAV)载体，这种AAV载体在肝脏特异性启动子的控制下包装密码子优化的F8或F9变体转基因基因组。

AAV具有安全性好、宿主范围广和在体内表达时间长等特点，成为当前最有前景的血友病体内基因治疗载体。当前基因治疗产品中使用的肝脏特异性启动子是带有来自ApoE增强子元件的人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子的迭代或经修饰的转甲状腺素启动子。

 

表1 正在进行的血友病AAV基因治疗临床试验

（数据来源：Samelson-Jones BJ, George LA, Annu Rev Med， 2023）

 

由于F8 cDNA(7kb)全长超过了AAV载体(~4.7kb)的包装能力，因此基于AAV的HA基因治疗方法使用B结构域缺失的FⅧ变异体。虽然B结构域占F8基因的40%，但它不是凝血活性所必需的。大多数研究使用FⅧ-SQ变体，该变体也用于商业重组FⅧ产品。一项试验正在评估一种新型B结构域缺失的FⅧ变体(FⅧ-V3)，该变体在剩余的B结构域替代连接子上添加了额外的糖基化位点，以改善蛋白质分泌。

F9 cDNA(1.6kb)很容易被包装在AAV载体中。早期基于AAV的HB基因治疗研究使用了野生型FⅨ。然而，目前针对HB的AAV基因治疗方法使用FⅨ-R338L(FⅨ-Padua)变体，这是一种自然发生的错义突变，导致FⅨ活性相对于野生型FⅨ提高约8倍。R338L的替换导致活化的FⅨ-R338L与活化的FⅧ之间的相互作用增强，但与野生型FⅨ相比，它不会改变FⅨ-R338L的活化或失活。

 

2. 抗AAV抗体的作用

尽管尚未完全了解预先存在的体液性AAV免疫的临床意义，但是预先存在的AAV中和抗体会限制靶组织转导，从而限制基因治疗效果。AAV抗体被量化为总AAV结合抗体或特异性AAV中和抗体(neutralizing antibodies，NAb）。然而，NAb检测并不是标准化的，根据不同的方法会产生不同的结果，从而使个别研究观察的概括性复杂化。报道的NAb滴度是限制载体转导50%所需的血清稀释度。

抗AAV NAb抗体在自然感染野生型AAV或给予系统性重组AAV载体后产生。然而，给药后产生的AAV NAb滴度通常比环境暴露后产生的AAV NAb滴度至少高一个对数倍。环境暴露导致了大约30%的NAb血清阳性，尽管这一比例因地理位置、检测方法和血清型而有很大差异。由于AAV血清型2（AAV2）是地方性的，人类对AAV2的NAb血清阳性率最高，且通常发生在儿童时期。首批接受系统性AAV载体给药的受试者小队列分析显示，AAV给药后可产生持续长达15年、多血清型交叉反应的NAb，这些结果与人类自然感染后产生的NAb持久性和临床前动物模型中系统性AAV载体注射后结果一致。重要的是，没有临床数据支持有效策略来克服AAV 全身给药后的NAb滴度。因此，目前的数据表明，重复给药（相同或不同血清型）AAV载体不会产生疗效。

在进行AAV载体全身给药的第一项人体研究（该研究在HB男性中进行）中发现了预先存在的NAb的疗效限制。研究发现，与滴度为1:17的受试者相比，在NAb滴度＜1:5的受试者中观察到较高的FⅨ转基因水平。基于这些有限的数据，后续的血友病基因治疗大多排除了NAb滴度＞1:5的患者。然而，即使是低滴度的NAb也可能影响疗效。作者观察到，在评估FⅨ-R338L治疗HB的第一次成功试验中，唯一具有可测量的NAb滴度（1：1）的受试者的FⅨ活性水平低于其他7名完全持续表达转基因的受试者，后者的滴度为阴性（＜1：1）。

最近，一项针对HB的全身性AAV5载体给药（AMT-061，etranocogene dezaparvovec）的临床项目对NAb在限制疗效方面的作用提出了质疑。在最初的Ⅰ/Ⅱa期研究中，排除了AAV5 NAb阳性的参与者。然而，用更灵敏的基于荧光素酶的NAb检测方法进行的回顾性分析表明，在给药之前，10名受试者中有3名可检测到AAV5 NAb（范围1：21-1：340），但转基因表达没有明显差异。在NAb滴度高达1:10000的非人灵长类动物中进行的临床前研究同样显示不存在转基因表达减少。因此，在随后的Ⅱb和Ⅲ期研究中，NAb滴度不是排除标准。公布的Ⅱb期数据显示，在3名基于荧光素酶的NAb滴度在1:20至1:50之间的受试者的FⅨ活性水平为30-60%。在Ⅲ期研究中，54名受试者报告了类似的FⅨ活性水平，然而，NAb滴度最高的受试者（＞1:3000）没有反应。这些结果表明，区分可治疗和难治NAb滴度的阈值取决于NAb检测方法的特性、给药的载体和载体剂量，而不是证明预先存在的NAb与全身AAV疗效无关。事实上，AMT-061的载体剂量（2 × 10¹³vg/kg）是研究中以NAb滴度1:5作为排除标准（例如，5 × 10¹¹vg/kg）的AAV载体的40倍。这与动物中的研究结果一致，证明了载体剂量和阻止转基因表达所需的NAb阈值滴度之间的非线性关系。监管机构批准用于血友病的AAV载体可能会根据相关关键研究的纳入标准，包括抗AAV抗体的cutoff值。

由于预先存在的抗AAV抗体可能会阻止载体再给药，并限制了可接受AAV基因治疗的患者数量，因此正在开发消除或避免预先存在的抗体以及载体给药后形成抗体的方法。到目前为止，缺乏动物实验数据证明能够克服全身AAV载体给药后观察到的NAb滴度的大小（即＞1:1000）。鉴于AAV治疗血友病的临床研发现状和短期内有显著改善活性的潜力，目前有效的载体再给药策略是临床医生和血友病患者在决定基因治疗产品时最重要的考虑因素之一。应明确告知患者，使其充分意识到目前的临床开发状态可能只允许终生一次全身AAV载体给药。这对于防止一种载体最终逊于另一种载体时的“买方悔恨”非常重要，并强调在给药之前全面了解每种载体的所有可用信息的重要性，以确保做出明智的决定。

 

3. AAV治疗的短期安全性考虑

迄今为止，在血友病患者中评估的300倍范围的AAV全身给药剂量（2 × 10¹¹—6 × 10¹³vg/kg）没有出现重大的安全性问题，尽管有描述无症状肝毒性和免疫反应。然而，研究比血友病使用的载体剂量更高的AAV基因治疗试验中,最近揭示了载体剂量为1 × 10¹⁴vg/kg时观察到的主要安全性问题，并提示系统性AAV载体给药的剂量限制性毒性。虽然剂量限制性毒性在药物开发中不是一个新概念，但现在有证据表明这一常规性概念也适用于系统性AAV载体给药。

3.1 AAV新出现的短期毒性反应

在其他疾病队列中观察到的AAV毒性与血友病基因治疗的直接相关性尚不明确。这些新出现的观察结果至少为使用最低载体剂量提供了理论依据，并支持治疗医生将AAV纳为治疗方法之一。例如，在一些评估全身AAV载体剂量大于1.1×10¹⁴vg/kg的神经肌肉试验中，观察到在接受治疗后2周内出现血栓性微血管病（thrombotic microangiopathy，TMA），并伴有补体激活，这与非典型溶血性尿毒症综合征相一致。虽然相关文献发表较少，但已报道的数据概述了终末器官TMA毒性，包括恶性高血压、需要血液透析的肾衰竭和对依库丽单抗（eculizumab，用于治疗非典型溶血性尿毒症综合征）的反应。然而，这种治疗方法并非普遍有效，因为治疗结局中包括至少有一名患者的死亡与TMA并发症有关。

除了TMA，最近在对256个非人类灵长类动物的荟萃分析中确定了使用AAV载体对脊神经节（dorsal root ganglia，DRG）短期和长期毒性的可能性，这些非人类灵长类动物接受了33种不同的载体，包括不同的血清型、表达盒和给药途径（鞘内、脑池内和系统性全身）。一些动物表现出轻微的DRG毒性，只有两只动物有临床症状和严重的组织学结果。这一主要组织学结果的病因尚不清楚，但推测与转导的DRG细胞中未折叠的蛋白质反应有关。截至目前，这种毒性的临床确认仅限于一例接受鞘内注射AAV载体治疗肌萎缩性侧索硬化症的受试者。使用糖皮质激素可以减轻症状，但在本文发表时并未得到改善。目前尚不清楚DRG毒性是否取决于AAV衣壳、剂量、基因盒、给药途径，以及AAV载体平台毒性。

3.2 AAV的肝毒性和免疫学反应

无论靶细胞如何，所有AAV血清型都能有效地输送至肝脏。因此，肝毒性是AAV系统递送的主要安全考虑因素。所有血友病的AAV基因治疗试验中都显示了无症状的肝细胞毒性，但其频率和疗程取决于所使用的载体和剂量。这种肝细胞损伤模式的特征是转氨酶升高，即丙氨酸转氨酶升高超过天冬氨酸转氨酶升高，而胆红素或γ-谷氨酰转移酶未相应升高。在大多数（但不是所有）情况下，伴随着因子活性的下降，而这些因子活性可能对免疫调节有反应，也可能无反应。在一项HA关键试验中，给药后，单一AAV载体导致了病因不明的转氨酶升高，持续数月，且与因子活性下降无关，也没有证据表明患者对免疫调节有应答。大多数受试者（n=114/134）在无疗效证据或无明确治疗病理的情况下接受了转氨酶升高的免疫调节。

然而，在血友病试验中观察到的大多数转氨酶升高发生在对AAV衣壳产生细胞毒性免疫应答的情况下。据推测，这种AAV“衣壳免疫反应”是衣壳特异性细胞毒性CD8+T细胞识别在转导肝细胞的主要组织相容性复合体I分子上呈现的AAV衣壳肽并清除的结果。如果有足够多的转导肝细胞作为靶点，这在理论上会引起安全问题。然而，迄今为止，AAV衣壳细胞免疫反应在很大程度上是血友病基因治疗的疗效考虑因素，在多项试验中造成了部分或全部转基因表达的丧失。衣壳免疫反应的特征是转氨酶升高、因子活性下降，以及在干扰素-γ抗衣壳蛋白酶联免疫斑点（ELISpot）检测中，外周血单核细胞通常(但不总是)会对AAV衣壳多肽产生反应。值得注意的是，ELISpot检测法在不同临床试验中的预测价值不同，并且由于技术要求高，不太可能在获得许可后翻译。尽管如此，即使是轻度的转氨酶升高和因子水平下降也被证明对衣壳免疫反应相当敏感。衣壳免疫反应通常在接受AAV载体治疗后12周内可观察到。

一旦有证据表明存在衣壳免疫反应，就必须进行免疫调节，以维持转基因表达。研究人员采取了多种策略，其中以糖皮质激素为主。重要的是，免疫调节并不是普遍成功的，可能受到载体相关元件和受体相关元件的影响。迄今为止，合理设计的免疫调节方案仍难以捉摸。最后，免疫调节的持续时间有很大差异，从几周到一年以上不等，由此产生对安全的关注。为更好地评估免疫抑制的风险/益处，必须了解正在治疗的是什么，并确认干预是必要和有效的。

虽然血友病患者接受AAV基因治疗后未观察到肝衰竭，但针对其他两种遗传疾病的AAV基因治疗已观察到肝衰竭。具体来说，用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的onasemnogene abeparvovec（Zolgensma®）剂量为1.1×10¹⁴vg/kg，该药物在获批时附有肝毒性的黑框安全警告（boxed safety warning）。获得许可后，两名患儿在接受治疗后6-8周出现急性肝衰竭，且对糖皮质激素干预有反应。虽然确切的病因尚不清楚，但AAV衣壳细胞免疫反应与载体注射时间、CD8+T细胞浸润的肝活检标本和对类固醇的反应显著相关。最后，与血友病试验和Zolgensma试验中观察到的肝细胞毒性不同，一项关于X-连锁肌管肌病（X-linked myotubular myopathy，XLMTM）的研究中，使用了迄今为止在人类中使用的最高载体剂量进行AAV介导的基因递送，观察到4名试验受试者的肝胆毒性进展为肝衰竭和死亡[3.5×10¹⁴vg/kg剂量组有3人（n=3/17）；1.1×10¹⁴vg/kg剂量组中有1人（n=1/7）]。XLMTM的肝胆损伤类型和不明确的自然史（可能包括潜在的肝脏疾病）与衣壳免疫反应不一致。这些严重的肝毒性与血友病基因治疗的相关性尚不清楚，但它们的发生支持在AAV基因治疗中尽可能使用低的AAV载体剂量，并在开具AAV基因治疗处方之前充分了解潜在的AAV毒性。

4. AAV治疗的长期安全性考虑

假设系统性AAV载体给药的长期安全性问题仍然是肝脏和靶器官毒性以及遗传毒性的风险。虽然AAV主要是非整合性的，但环境暴露或注射AAV载体后动物和人类的测序数据表明，低频率的AAV整合事件倾向于活性转录位点。对新生小鼠进行AAV载体系统性给药表明，AAV在Rian位点（没有直接的人类同源基因）的整合导致了克隆性和近乎完全的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC）外显性。随后的一项研究确定HCC风险与载体剂量和细胞分裂程度相关，使用肝细胞特异性启动子可消除HCC风险，但使用非肝细胞特异性启动子会增强HCC风险。最近在大型动物HA模型中也证实了系统性给药后AAV整合和克隆性的证据。然而重要的是，同样的动物被随访10年，并没有肿瘤发生的证据。尽管如此，该研究首次提供了大型动物数据来强调AAV介导的整合风险。

血友病患者使用AAV基因治疗后发生肝癌的理论风险难以明晰，因为几乎所有45岁以上的严重血友病患者都有医源性获得的乙肝病毒和/或丙型肝炎病毒，导致相对于普通人群而言，HCC发病率升高。尽管在队列规模和纵向随访方面受到限制，但AAV基因治疗在血友病和其他疾病队列中的临床试验数据令人放心。在血友病基因治疗中，有一名长期感染丙型肝炎病毒的受试者在注射AAV载体1年后发展为HCC。最近对肿瘤组织的测序分析发现了预期的低频率随机AAV整合，但不存在克隆性，也不存在其他与丙型肝炎相关HCC中发现的突变，这表明AAV载体输注并不是导致患者HCC的诱因。除此之外，在数百名血友病基因治疗试验受试者中，即使在第一批接受系统性AAV载体给药的HB患者的15年随访数据中，也没有出现HCC的报道。总之，到目前为止，没有临床数据直接证明AAV载体输注是HCC发展的危险因素。然而，这种理论上的风险只会在AAV载体给药后的几十年里出现。考虑到在接受AAV载体治疗后肿瘤发生的长期风险以及血友病人群HCC风险增加的多重未知因素，作者的观点是接受AAV基因治疗的血友病患者，应在接受治疗后的几十年期间通过血清甲胎蛋白水平、肝功能检查和肝脏超声检查来监测HCC和长期的肝脏毒性。成年血友病人群以外的队列与AAV载体给药后小鼠HCC发展的危险因素更接近。具体来说，婴儿的风险因素—肝脏的快速生长和由此产生的高细胞分裂率，接受系统性给药AAV载体高剂量和泛素启动子（如给予SMA婴儿的Zolgensma）更接近于小鼠模型中确定的遗传毒性风险因素。因此，这些婴儿是一个重要的队列，需要仔细随访以回答有关AAV载体系统性给药后AAV遗传毒性和HCC的人体风险问题。

5. 转基因衍生蛋白的短期和长期安全性考虑

转基因衍生蛋白的主要安全性考虑包括(a)对自身抗原有或没有交叉反应的免疫反应和(b)血栓形成前的风险。考虑到迄今为止在HA和HB基因治疗试验中观察到的FⅧ和FⅨ的异质表达，血栓形成前的风险是显著的。超生理水平的FⅧ和FⅨ活性是静脉血栓形成的独立危险因素。流行病学资料显示，超生理FⅧ活性的静脉血栓形成风险[比值比(OR)8.8-21.3]高于FⅨ[静脉血栓形成OR值1.8-4.0]，尽管两种情况都不理想。事实上，一名HB研究对象表达了超生理水平的FⅨ活性（200-520%），导致在其动静脉瘘中形成血栓，并接受了抗凝治疗。同样，最近辉瑞公司赞助的一项Ⅲ期AAV基因治疗试验，因一名受试者超生理水平的FⅧ表达和静脉血栓形成而暂停。由于这些原因，HA或HB基因治疗的治疗窗口可能在正常因子水平的上限结束。

除了超生理水平的表达外，理论上还可以通过一种增强的止血功能变异蛋白（如FⅨ-R338L）来增加血栓形成前的风险，该蛋白目前已应用于所有的HB基因治疗工作中。重要的是，FⅨ-R338L的调控方式与野生型FⅨ相同，这与临床前数据一致，表明血栓形成风险与FⅨ活性相关，而与野生型和FⅨ-R338L的表达无关。综上所述，这些结果支持FⅨ-R338L本身不会促进血栓形成的结论。

此外，虽然对表达的转基因可能产生多种免疫反应，但迄今为止还没有开发出针对转基因衍生蛋白的NAbs。值得注意的是，目前血友病基因治疗试验的纳入标准严格排除了最有可能产生抑制物的患者（例如，目前或既往有抑制物病史的患者，或因子暴露＜50-150的患者）。然而，小型和大型动物的数据表明，肝细胞表达转基因会诱导转基因耐受，这一点已在多种蛋白质中得到证实，包括FⅧ、FⅨ和FⅨ-R338L。此外，现有的临床前数据表明，肝脏定向基因转移可能诱导转基因产物免疫耐受。因此，在肝脏定向基因治疗后，对转基因蛋白的持续免疫反应是不可能的。事实上，基因治疗的未来扩展适应症可能包括预先存在FⅧ抑制物的HA患者的耐受性诱导。由美国国家心肺和血液研究所（NHLBI）主办的“FⅧ抑制物的科学现状”研讨会提出的共识建议明确支持采用基因疗法诱导HA的FⅧ耐受。然而，最近在杜氏肌营养不良患者接受AAV载体肌肉定向基因治疗后，发现了针对转基因蛋白的抗体，假设这些抗体与自身抗原有交叉反应，这突出了AAV基因治疗单基因疾病的一些未知因素。

6. 血友病基因治疗的现有疗效数据

在持续转基因表达的临床试验中，大多数持续转基因表达的受试者表现出表型改善。与目前的血友病治疗方法相比，基因疗法有可能取得更好的疗效，这一点是无可争议的。此外，尽管因子表达水平存在异质性，但年化出血率（annualized bleeding rate，ABR）的短期降幅相对一致。然而个别载体，特别是HA载体，可能会根据其表达持久性和长期疗效而有所区别。

 

  

图1 AAV基因治疗临床试验的受试者在注射AAV载体前后的年化出血率（ABR）。(a)血友病A和(b)血友病B。

（图片来源：Samelson-Jones BJ, George LA, Annu Rev Med, 2023）

 

虽然流行病学研究提供了避免超治疗表达和由此产生的安全问题的有力解释，但精确的最小期望因子活性仍不清楚，可能因患者特征（如活动水平和关节健康）而异。目标最小期望因子活性可以根据现有的HA自然历史数据建模，这些数据表明，一期FⅧ活性≥12%意味着ABR＜1。此外，emicizumab预防可使超过50%的受试者ABR＜1，且体内FⅧ止血当量估计为10-30%，这些发现和血友病自然历史数据普遍支持类似的目标最小表达量。事实上，到目前为止，对累积的现有基因治疗数据的分析支持了这些近似的结论，在这些数据中，通过一期法检测，持续性保持FⅧ活性＞10-20%，使得大多数受试者的ABR＜1。

 

图2 年化出血率（ABR）与FⅧ活性的关系。(a)所有基因治疗受试者的ABR和FⅧ活性。(b)ABR≤1的基因治疗受试者百分比与一期法测定的FⅧ活性的关系。

（图片来源：Samelson-Jones BJ, George LA, Annu Rev Med, 2023）

 

然而，根据AAV载体的不同，观察到的转基因表达变化为10-100倍。因此，不可能满足个别患者的因子阈值需求。此外，在与人肝细胞嵌合的小鼠克隆群体中进行的研究表明，仅在转导效率方面就存在高达7倍的差异。这些数据表明，从载体输注到转基因稳定表达之间每一步都受到多种生物变量的影响，并强调了在不久的将来，该领域可能不得不容忍患者之间转基因表达的可变性。

使我们无法明确定义靶向和可接受的转基因表达的治疗范围的是，对测定的转基因FⅨ或FⅧ活性与体内止血功能的相关性的置信度。具体来说，通过一期法（OSA）或显色法（CSA）检测转基因衍生的FⅧ-SQ和FⅨ-R338L的结果差异较大。在人类和小鼠中，通过OSA测得的FⅧ: C比通过CSA测得的高出约1.6倍，这一观察结果在重组FⅧ-SQ蛋白20年的临床应用中未曾见。同样，FⅨ-R338l OSA测得的FⅨ活性高于CSA测得的FⅨ活性。然而，与转基因衍生的FⅧ-SQ不同，重组FⅨ-R388L的相对测定差异保持不变，总体上与我们对FⅨ-R338L酶功能的理解一致。

7. 转基因表达的持久性

尽管在因子表达成功但不稳定的情况下，不同载体的短期临床疗效相对相同，但在长期稳定表达方面存在差异。大型动物的实验数据显示，在载体输注后长大8年的时间里，FⅨ或FⅧ的表达量保持稳定且均未下降。迄今为止，现有的HB临床试验数据与大型动物实验数据中观察到的情况相似。已公布的长达3年的数据和长达8年的摘要数据都证明了FⅨ表达的持久性和稳定性。而在HA中表达持久性的数据是不一致的。

  

图3 AAV基因治疗数年后的因子Ⅷ(FⅧ)活性。

（图片来源：Samelson-Jones BJ, George LA, Annu Rev Med, 2023）

 

具体而言，在目前进行的HA Ⅲ期试验的载体中，两种载体都显示，从第一年到第二年，FⅧ表达水平下降了近一半。其中valoccogene roxaparvovec（AAV5-FⅧ或BMN-270）现已证明，在Ⅰ/Ⅱ期试验7名受试者的6年随访中显示FⅧ水平持续下降。在更大的Ⅲ期试验受试者队列（n=17）中也观察到类似的结果，FⅧ表达量减少了40%，并且在目前可用的3年随访数据中，FⅧ活性持续下降。有趣的是，在接受SB-525（giroctocogene fitelparvovec）治疗并随访2年的受试者（n=4）的Ⅰ/Ⅱ期数据密切反映了使用valoccogene roxaparvovec后观察到的FⅧ水平下降的情况下。与valoccogene roxaparvovec和giroctocogene fitelparvovec的观察结果不同，在接受SPK-8011治疗并在衣壳免疫反应外维持FⅧ表达的受试者（n=5）在载体输注后3年内表现出明显稳定的FⅧ表达水平。虽然SB-525和BMN27的FⅧ长期药代动力学似乎相似，但与使用SPK-8011的观察结果明显不同。这证明了目前HA AAV介导的基因治疗策略可以实现多年稳定的FⅧ表达。

在HA临床试验中观察到的表达持久性差异的病因尚不清楚。鉴于目前的策略目标是维持游离转基因，因此正如目前在HB方面的研究所证明的那样，预计由于细胞分裂和损失，表达量会有一定程度的下降（渐进式）。图3所示的综合数据可能表明，高水平的转基因FⅧ是不可持续的。然而，仔细观察接受valoctocogene roxaparvovec治疗后个别受试者的FⅧ水平，并没有发现FⅧ表达水平与FⅧ下降之间的明确关系，这需要进一步的研究。目前在Ⅲ期试验中观察到的两种HA载体中FⅧ表达下降的假设机制包括：（a）由于直接载体或FⅧ的毒性导致转导细胞损失，（b）基因沉默，（c）对AAV衣壳或表达的转基因未检测到的免疫反应，或（d）单个载体的特性导致无法形成稳定的外显子载体基因表达盒DNA。不同AAV产品的生产平台如何导致转基因FⅧ水平的下降也是未知的。鉴于我们对AAV载体输注后持续、高滴度、多血清型、交叉反应的AAV NAb发展的了解，以及我们目前无法克服高滴度的AAV NAbs, FⅧ表达水平的稳定性是决定临床试验招募或许可AAV产品选择的关键考虑因素。患者需要充分了解他们只能接受一次AAV基因治疗，并且必须在风险/收益计算中考虑FⅧ转基因表达的损失。

8. 未来发展方向

在当前进展的基础上，许多新方法已蓄势待发。包括使用FⅧ变体改善分泌或止血功能的新一代AAV载体，以及用于基因编辑的带有脂质纳米颗粒的AAV载体。虽然仍处于临床前开发阶段，但其中一些方法有望很快用于临床。此外，针对肝脏的系统性给药以及使用慢病毒载体对造血干细胞体外转导的临床前或首次人体临床试验也在进行中。目前的研究将所有儿科患者以及无法获得常规治疗的患者（占世界血友病人群的大多数）排除在外，但基因疗法可能对这些人群产生最大的影响。

9. 结论

基于AAV的基因补充治疗在血友病和其他单基因疾病方面的进展确立了一个新的治疗范例。了解AAV平台以及全面掌握迄今为止有关单个载体的信息，对于在知情的情况下同意接受研究性载体或已获许可的载体进行治疗是非常必要的。血友病领域迫切期待当前一代已获许可的用于HA和HB的AAV载体，预计这些载体不久将在临床上应用。重要的是，尽管目前的血友病基因治疗反复证明了概念的成功，但能够在所有患者中实现稳定、持久的FⅧ或FⅨ表达并减轻出血仍然是一个未实现的希望，这确定了下一代血友病基因治疗的发展目标。