2023-09-07
近日，AAV基因疗法公司Taysha Gene Therapies（Taysha）宣布完成1.5亿美元融资，绝地逢生，股价涨幅超200%。Taysha是一家专注于开发和商业化基于AAV的基因治疗产品的临床阶段基因治疗公司，以消除单基因中枢神经系统（Central nervous system，CNS）疾病为己任。该公司有多条基因治疗研发管线，其中，用于治疗瑞特综合征的自我互补鞘内给药AAV9基因替代疗法TSHA-102在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中获得了令人满意的结果。据悉，FDA已对其授予快速通道资格。
Taysha基因治疗研发管线（图片来源：Taysha官网）
神经系统疾病是全球致残的主要原因和第二大死亡原因，多种疾病是由于遗传基因突变导致神经和神经元功能异常引起。由于血脑屏障（Blood-brain barrier，BBB）的存在限制了传统药物治疗的有效性，使CNS疾病的新药研发尤为困难。基因疗法“一次治疗，终生有效”的优势为CNS疾病患者带来治愈的希望。随着AAV基因治疗药物Zolgensma（用于治疗脊髓性肌萎缩症SMA）和Upstaza（用于治疗芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症）的接连上市，更加提高了人们的期望。
然而，事物的发展并非一帆风顺。AAV基因疗法的临床疗效仍会受到免疫原性、致病性等因素的限制。本期为大家带来发表在Journal of Controlled Release上的综述——AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges。文中概述了AAV基因治疗在14种CNS疾病中的临床研究进展、存在的瓶颈和解决方案。从病毒载体技术、给药途径、免疫抑制和其他相关临床因素几个方面，阐述了提高AAV基因疗法在CNS疾病中安全性和有效性的策略，以期能有助于临床前研究的高效转化和临床试验的广泛运用。
图形摘要（图片来源：Kang L et al., J Control Release, 2023）
1.病毒载体的开发
1.1 AAV衣壳蛋白开发
rAAV衣壳能够有效地穿过BBB，并可在神经系统中提供安全、长期的表达，已成为CNS基因治疗的首选载体。迄今为止，临床研究中使用较多的血清型主要有AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9和AAVrh10。然而，由于递送效率低等原因，AAV在全脑表达的效果不佳，开发高感染效率的新型AAV载体仍是值得关注的问题。新衣壳蛋白的开发策略不断演变，目前主要为：天然发现、合理设计和定向进化。
天然发现是指从天然来源wtAAV中分离出来的血清型。已上市的四种AAV基因治疗产品均是基于天然发现——AAV1（Glybera）、AAV2（Luxturna）、AAV9（Zolgensma）、AAV2（Upstaza）。由于大多数人预先存在针对某些AAV血清型的结合抗体，因此从非人灵长类动物中分离出的衣壳显示出巨大的前景。
合理设计是指将有益的衣壳序列添加到某些AAV血清型的已知受体结合域，从而增加衣壳的组织嗜性，提高转导效率，并降低免疫应答。合理设计的难点主要在于对AAV与细胞表面受体结合、内化、运输、脱壳以及进行基因表达的生理过程还不够了解。
定向进化是指在衣壳蛋白中引入大量随机突变。构建衣壳突变体库的方法有三种：随机插入寡核苷酸序列、DNA改组和易错配PCR。定向进化利用遗传多样性来改善生物分子的功能，已经成功发现了CNS定向衣壳，如AAVrh10。
总之，目前临床研究中最安全、最广泛使用的仍是基于天然发现的衣壳蛋白。基于定向进化的衣壳蛋白可以满足多样化的临床需求，在将来的临床试验中具有广阔的应用前景。
图1 AAV衣壳蛋白开发策略。A. 天然发现，B. 合理设计，C. 定向进化。
（图片来源：Kang L et al., J Control Release, 2023）
1.2 标准化载体生产
标准化载体生产是保证rAAV质量和数量以满足大量临床试验需求的重要环节。三质粒瞬时转染HEK293细胞系平台使用最为广泛。但该方法存在可放大性方面的问题。为提高生产效率和稳定性，已经开发了各种rAAV生产平台。如杆状病毒表达载体系统（Bac/Sf9）和辅助病毒（如腺病毒，HSV）/哺乳动物细胞（如HeLa细胞）系统。
纯化过程的目的是去除可能引起免疫反应和影响临床疗效的杂质。在临床实践中，最常用的纯化程序是将传统方法（氯化铯/碘克沙醇密度梯度离心，亲和层析）和新技术（疏水层析HIC、阳离子层析，切向流过滤TFF）结合起来，以实现稳定的生产。rAAV的安全性在很大程度上依赖于产品的表征和生产工艺的监测，但对于最优AAV载体质量的关键工艺步骤仍缺乏行业共识。目前业内已开发出灵敏、特异及准确的检测含量、效价以及纯度等指标的方法。
图2 rAAV载体生产工艺。A. rAAV生产平台，B. rAAV载体纯化，C. rAAV载体QA。
（图片来源：Kang L et al., J Control Release, 2023）
2.给药途径
脑实质给药利用立体定向手术系统将高浓度的载体跨越BBB送达到目标区域，是最受欢迎的CNS给药途径，其优点是可直接靶向目标脑区，已成功应用于纹状体、丘脑、尾状核、白质、黑质等脑区，给药剂量范围为109-4.7×1012vg。缺点是给药范围有限且是一种侵入性的过程，可能引起额外的病理变化。临床上已经开发出许多其它策略来改善病毒的分布，如对流增强给药（Convection-enhanced delivery，CED）、与肝素或甘露醇同时给药、与磁共振成像造影剂同时给药等。
脑脊液内给药的优点是可将治疗基因在大脑或脊髓中表达更广泛。缺点是由于范围更广，会引起更严重的免疫反应。给药方式有三种途径：鞘内、脑室内和枕大池内给药。鞘内给药是最不侵入性的脑脊液内给药方法，通过腰椎穿刺将AAV送至脊髓。脑室内给药是指穿过脑实质的室腔，将AAV送至大脑，目前仅在黏多糖症Ⅲ型（MPS Ⅲ）的临床研究中使用。枕大池内给药可以使AAV广泛分布在小脑、脑干和脊髓中。与腰椎穿刺途径相比，枕大池内给药效率提高了100倍，但缺点是可能会导致针头插入髓质，造成脑干损伤。脑脊液内给药剂量范围为1012-4.2×1014vg。
静脉给药是最不具侵入性的给药方法。临床试验中使用的血清型主要是AAV9和AAVrh10，它们具有跨越BBB的能力。静脉给药剂量高达1015vg。由于静脉给药的主要靶点是肝脏，在全身暴露后可能出现免疫反应和肝毒性。然而，在成熟的免疫抑制策略的临床研究中，很少观察到这些不良反应。静脉给药的另一局限性是BBB的存在会降低给药效率。
综上所述，更大的给药范围可能伴随着更严重免疫反应，但也会带来更好的临床疗效。因此，在风险-收益的平衡中需要考虑多个参数。针对神经退行性疾病，局部给药途径是首选，因为其最大限度地提高了给药效果的同时最小化安全问题。脑脊液内给药是一种新兴的方法，可以实现广泛的给药范围。静脉给药是一种已成功应用于特定疾病的新方法。当一种给药途径过于受限或疾病影响多个CNS区域时，可以组合使用多种给药途径。
图3 AAV进入中枢神经系统及相关疾病的途径和衣壳蛋白。A. 中枢神经系统给药途径示意图，B. 不同临床给药途径所涉及的疾病和衣壳。（图片来源：Kang L et al., J Control Release, 2023）
3.宿主反应
AAV载体的免疫原性产生主要来自于三个方面：人体存在对于wtAAV的免疫记忆（基因治疗前已存在），AAV载体诱导的天然免疫和适应性免疫，基因转导产物诱导的免疫反应。预先存在的免疫原性在人类中普遍存在，大多数个体已感染wtAAV，因此他们的血浆中已经有抗体（IgG和IgM）和补体。当这些个体再次感染AAV，并且BBB被破坏时，其中一些抗体会中和AAV的衣壳蛋白，并阻碍基因转导效率。在不同的临床试验中，免疫策略、手术技术、BBB完整性、AAV制剂等存在差异。因此，中和抗体(NAb)滴度及疗效之间的相关性上没有统一的结论。
AAV载体引起的天然免疫反应较轻微且短暂，长期以来人们对AAV引起的天然免疫反应并未给予足够重视。然而，在基于AAV的基因治疗试验中出现的一些严重的不良事件，甚至导致死亡，使我们再次关注这一问题。这一领域的发展仍需优化分析方法和更丰富的专业知识。
适应性免疫发生在先天免疫之后，并持续很长时间，从而可以进行抗原特异性识别。适应性免疫主要由T淋巴细胞（T细胞）诱导。抑制T细胞功能的免疫抑制剂可有效避免适应性免疫的发生，包括皮质类固醇、西罗莫司、他克莫司、麦考酚酸酯或环孢霉素。