研究概述

2025年3月28日，美国马萨诸塞大学Chan医学院Horae基因治疗中心的高光坪教授团队在《Molecular Therapy》期刊发表题为“The curious case of AAV immunology”的综述论文，该综述主要探讨了腺相关病毒（AAV）免疫学机制的复杂性，包括AAV与宿主免疫系统的相互作用、临床应用中的免疫挑战和优化策略，以及未来研究方向。

The curious case of AAV immunology

重组腺相关病毒（rAAV）因其高效递送遗传物质的能力成为基因治疗的核心载体。然而，免疫系统将这些AAV载体视为外来物和潜在的病原体，由此产生的免疫反应引发了重大的安全性问题，对治疗性基因转导的持久性产生了负面影响，并且在需要时可能会阻碍重新给药。因此，当前亟需解析rAAV免疫激活的分子机制，并开发免疫调控策略以平衡治疗效力与安全性，这也是该领域未来研究的核心方向。

1.rAAV、宿主细胞与免疫系统的相互作用

免疫系统对AAV的识别

AAV载体具有低免疫原性和无致病性。然而，对AAV载体的先天免疫反应仍会影响其疗效和安全性。随着临床试验中载体剂量的不断增加，研究人员观察到对AAV的不良免疫反应也同样增加，这可能是由于触发了先天免疫途径，同时激发了适应性免疫系统而产生。

研究表明，AAV能够被多种模式识别受体（PRRs）识别，包括Toll样受体（TLR）2、TLR9、cGas和RIG-I/MDA5（图1）。TLR9、cGAS和RIG-I/MDA5会激活宿主的干扰素（IFN）反应。TLRs通过接头蛋白（如MyD88和TRIF）发出信号，导致IRF3、IRF7和核因子（NF）-κB的激活，以及Ⅰ型IFN和促炎细胞因子的产生。IFN反应能够激活自然杀伤（NK）细胞和其他先天免疫效应细胞，这可能会降低转导效率。补体是AAV先天免疫反应的主要组成部分，可以通过经典途径、替代途径和凝集素途径激活。经典途径和替代途径与基因治疗最为相关，因为它们在临床前和临床研究中均被证实与AAV诱导的补体激活有关。然而，凝集素途径也可能对AAV的宿主反应有所贡献，可能是因为AAV衣壳上丰富的甘露糖化N-糖链激活了凝集素途径，或者在内皮损伤后激活。

野生型AAV（wtAAV）和重组AAV（rAAV）会引发强烈适应性免疫反应。适应性免疫反应针对特定抗原产生免疫记忆，可通过AAV衣壳或rAAV的转基因诱导，AAV受体的HLA基因型可能在决定其适应性反应结果中起关键作用，这在COVID-19大流行期间发生AAV2相关的非A-E型急性肝炎的儿童中HLA-DRB1*04:01等位基因的高富集度中得到证实。

 

 

图1 AAV病毒颗粒中的免疫原性基序（图片来源：Keeler AM et al, Mol Ther., 2025）

针对AAV衣壳的抗体反应

自然发生病毒的血清阳性率在不同人群中均有发现，许多针对AAV的中和抗体（Nabs）在这些人群中普遍存在，但尚不清楚这些抗体如何影响基因治疗载体。研究指出，AAV基因治疗中，Nabs与结合抗体（Babs）存在正相关，但衣壳特异性Nabs的血清流行率更高。动物及临床研究证实，Nabs可阻断转基因表达，而Babs的作用尚不清楚。Nabs具有长期持久性，高滴度抗体在治疗后15年仍可检测，且对多种AAV血清型（如2/5/8）存在交叉反应，可能限制重复给药，这些发现对优化AAV治疗策略至关重要。

血清阳性状态可能限制患者参与临床试验或导致重复给药失效。当前核心挑战在于抗体检测方法缺乏标准化，导致结果难以横向比较，标准化缺失直接影响疗效评估与治疗策略优化。有研究显示，在AAV衣壳上已经鉴定出一些结构域区域或“抗原热点”，包括二十面体的3倍轴、5倍轴和2/5倍壁。这些区域是抗体容易结合的部位，可能与AAV的抗原性密切相关。因此，减少AAV衣壳上的“抗原热点”可能是开发免疫逃逸策略的一个潜在有影响的领域。

针对AAV衣壳的T细胞反应

针对衣壳的T细胞反应主要由抗原交叉呈递激活，表现为剂量依赖性CD8+T细胞反应，但可通过类固醇抑制；同时在一些针对肌肉的临床试验中，发现调节性T细胞（Tregs）在肌肉靶向治疗中会诱导免疫耐受，支持转基因长期表达。针对转基因的免疫反应则与患者遗传背景及载体设计相关，CRIM阴性（如庞贝病）或使用截短型转基因（如DMD的微型肌营养不良蛋白）易触发抗药物抗体（ADAs）及T细胞反应，尤其自互补AAV（scAAV）因高表达增强免疫原性；特定HLA单倍型及促炎微环境（如DMD肌肉组织）会进一步加剧风险。此外，疾病类型与免疫耐受状态也会共同影响治疗效果。因此，个体化评估免疫风险，对提高治疗效果具有重要意义。

 

2.临床挑战及优化策略

免疫反应不仅限制基因治疗重复给药，还因T细胞反应的双重性（既可清除转基因表达也可维持表达）而复杂化。影响因素包括给药途径、衣壳设计、疾病表型、HLA状态、免疫抑制方案、个体差异等。降低免疫原性的策略目前聚焦于基因表达与衣壳工程：

基因优化：通过高活性转基因变体或密码子优化减少载体剂量，但需权衡CpG基序激活TLR9的风险，去除CpG或添加TLR9抑制序列可降低免疫原性，阻断3’-ITR转录可减少RNA传感器激活，而微RNA靶向技术可限制APC介导的适应性免疫。

衣壳工程：改造抗原热点可减少中和抗体识别，组织特异性衣壳能够提升靶向效率，酪氨酸突变可增强转基因表达并减少抗原呈递，化学修饰（如N-乙酰半乳糖胺配体、PEG化）和外泌体包裹可规避抗体中和并诱导耐受。此外，外泌体-AAV系统可改造淋巴细胞，拓展治疗潜力。这些策略旨在平衡转导效率与免疫逃逸，为临床优化提供多维解决方案。

 

3.给药途径在免疫反应中的作用

AAV载体的不同给药途径会导致不同的免疫反应，造成原因多样化（图2）。各组织免疫特性与给药途径的相互作用显著影响基因治疗效果，需针对性优化策略以平衡疗效与免疫风险。

眼部：作为免疫豁免部位，视网膜下注射虽可规避全身抗体影响，但可能引发局部炎症，如基因治疗相关性葡萄膜炎；玻璃体腔注射因接触淋巴组织更易触发免疫反应。

中枢神经系统：AAV9突破血脑屏障（BBB）实现CNS靶向，但CNS给药仍可诱导全身抗体升高及局部细胞浸润。

肌肉内注射：Nabs对局部给药影响有限，但系统性静脉给药受Nabs限制；T细胞反应呈现双重性，调节性T细胞促进转基因长期表达，但杜氏肌营养不良症中针对转基因的T细胞反应强烈。

系统性/肝脏：肝脏微环境支持免疫耐受，但临床中常需类固醇抑制短暂性转基因丢失及肝酶升高，目前已有三种肝靶向基因疗法获批。

耳部：内耳血-迷路屏障限制全身免疫暴露，但局部存在巨噬细胞及给药途径依赖性免疫反应（圆窗注射抗体水平低，后半规管给药会引发细胞浸润）。

 

 

图2 不同给药途径下AAV基因治疗的免疫反应（图片来源：Keeler AM et al, Mol Ther., 2025）

4.rAAV引发的免疫毒性

免疫毒性在注射后数天内以及给药后1年均有观察到，早期反应在基因治疗后数天到数周内更多地与先天免疫系统相关，而治疗后数周到数月内发生的事件更多地与适应性免疫系统相关（图3）。

先天免疫毒性：高剂量静脉给药，尤其是AAV9可激活补体系统，引发血栓性微血管病（TMA）及非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS），其机制涉及C5b-9膜攻击复合体导致内皮损伤；病例多与近期感染或疫苗接种相关，抗补体疗法及免疫调节（利妥昔单抗）可缓解，但患者遗传易感性（如补体因子Ⅰ变异）可能加剧风险。

适应性免疫毒性：针对衣壳或转基因的T细胞反应可导致肝毒性、免疫介导肌炎及心肌炎，肝毒性常通过类固醇控制。

心肌炎与神经毒性：DMD试验中心肌炎与转基因免疫反应相关，表现为肌钙蛋白升高及炎症浸润；背根神经节（DRG）毒性在ALS鞘内给药中有报告，但机制存在争议，非人灵长类模型提示可能与RNAi构建物相关。

多因素影响：毒性发生与载体剂量、给药途径（静脉/鞘内）、患者遗传背景及疾病表型密切相关。尽管多数毒性可通过免疫抑制缓解（如类固醇、西罗莫司），但部分案例（如DRG损伤）机制未明，需进一步区分免疫与非免疫因素。

 

 

图3 AAV基因治疗后免疫反应和免疫毒性的时间轴（图片来源：Keeler AM et al, Mol Ther., 2025）

5.缓解免疫毒性相关不良反应的管理方案

为调节对AAV基因治疗的免疫反应，临床和临床前都采取了多种策略。目前还没有针对AAV基因治疗的标准免疫抑制方案，但在设计适当的免疫抑制策略时会考虑多个因素。

当前临床策略：以皮质类固醇如泼尼松龙为核心，联合雷帕霉素、他克莫司或利妥昔单抗（抗CD20）抑制B/T细胞反应，从而缓解肝毒性及补体介导的TMA/aHUS（如三联方案减少抗体生成）。补体抑制剂（如eculizumab、ravulizumab、APL-9）通过靶向C5或C3阻断膜攻击复合体形成，降低内皮损伤风险。

实验性策略：聚焦降低免疫原性及重复给药障碍。1）抗体清除：血浆置换联合免疫吸附、细菌酶（Imlifidase、IceMG）裂解IgG/IgM、FcRn抑制剂缩短抗体半衰期；2）B细胞靶向：利妥昔单抗联合BAFF抑制剂或伊布替尼（BTK抑制剂）耗竭B细胞，协同MyD88信号抑制减少抗体记忆；3）先天免疫调控：TLR9抑制序列或ImmTOR纳米颗粒（含雷帕霉素）诱导耐受，在动物模型中实现多次重复给药。

耐受性诱导：通过工程化Tregs（如衣壳Tregitopes、CAR/TRuC-Tregs）或输注多克隆Tregs抑制抗衣壳/转基因免疫反应。A型血友病模型中，TRuC-Tregs较CAR-Tregs更能有效抑制抗药物抗体（ADAs）；BARs转导Tregs能成功诱导免疫耐受。

 

总结

腺相关病毒（AAV）基因治疗因缺乏典型病毒特性而被称为“几乎非病毒”，其高剂量引发的先天免疫反应较温和，但适应性免疫激活显著，且载体剂量与免疫毒性呈正相关。突破安全剂量阈值后，免疫毒性风险加剧。未来仍需多学科协同优化策略，深入解析病毒-宿主互作机制，开发免疫调节技术、增强载体靶向性以降低剂量，并平衡疗效与安全性。这些方向旨在减少免疫排斥、实现重复给药，推动安全高效的基因治疗发展。