2024-11-28
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是肝硬化(cirrhosis)和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的主要病因。目前，全球约有超20亿人感染过HBV，其中2.96亿人（约占总人口3.7%）患有慢性HBV感染，每年可导致全球约82万人死于肝硬化和HCC并发症。病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续存在是HBV抗病毒治疗的主要障碍，由于缺乏可行的动物模型来支持HBV cccDNA的形成，因此，HBV相关基础和转化研究受到很大的阻碍。
劲帆医药基于One-Bac昆虫杆状病毒系统平台与武汉大学夏宇尘教授课题组共同开发了一系列新型AAV-HBV-1.04乙肝造模病毒产品，通过ATR介导DNA损伤（DDR）形成HBV cccDNA，使乙肝表面抗原HBsAg和HBV子代产生，实现更好地模拟病毒复制过程。产品成模率高、稳定性好、适用范围广，加速推进了乙肝病毒复制机制的研究及抗乙肝药物的研发进程。
此外，劲帆医药还拥有专业的体内外药效评价团队，可提供肝脏疾病药物筛选、药效学评价、药代动力学研究、Non-GLP非临床安全性评价等服务项目，全面覆盖药物临床前研究的完整流程。
相关研究
2021年12月，武汉大学泰康医学院（基础医学院）医学病毒学研究所夏宇尘教授课题组在期刊《Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology》上发表题为“A Novel MouseModel Harboring Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA”的研究论文。该研究通过使用腺相关病毒载体（AAV）系统将复制缺陷的线性乙肝病毒基因组递送至小鼠肝脏，经过宿主ATR（Ataxia-Telangiectasiaand Rad3-related protein）介导的DNA损伤修复途径修复形成HBV cccDNA进而建立病毒持续复制的慢性乙肝模型。该模型可通过病毒表面抗原的表达指示HBV cccDNA的形成并用于抗病毒药物的临床前评估。
摘要图
（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）
1. 复制缺陷型pAAV-HBV 1.04载体制备
研究人员构建了HBV复制缺陷型载体AAV-HBV 1.04，该载体携带的HBV基因组从S基因区（核苷酸位点403-538）截断（图1A），并对AAV-HBV 1.04质粒转染的细胞、AAV-HBV 1.04病毒载体转导的细胞以及注射了AAV-HBV 1.04病毒载体的小鼠，评估了HBV复制标志物。
为验证pAAV-HBV 1.04载体复制缺陷型表型，研究人员将pAAV-HBV 1.2或pAAV-HBV 1.04质粒转染到Huh7细胞中（图1B）。实验结果表明，将pAAV-HBV1.2质粒转染到Huh7细胞中后，在细胞培养上清中检测到乙型肝炎e抗原（HBeAg）和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。而pAAV-HBV 1.04质粒转染后无法表达HBsAg（图1C），也未检测到代表新产生的病毒子代HBV-DNA（图1D）。结果证实pAAV-HBV 1.04载体本身无法支持HBV复制。
图1 pAAV-HBV1.04质粒的构建及验证
（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）
2. 体外AAV-HBV 1.04转导形成HBV cccDNA
为探究AAV-HBV 1.04病毒载体转导后是否能够形成cccDNA，研究人员对AAV-HBV 1.2和AAV-HBV 1.04载体进行滴定，并转导至HepG2细胞或AML12细胞中（图2A）。结果显示，AAV-HBV 1.2和AAV-HBV 1.04载体转导后均可导致HepG2细胞中HBeAg随时间显著增加（图2B）。与直接质粒转染不同，从AAV-HBV 1.04载体转导的细胞中可以检测到HBsAg，并且其表达量逐渐增加（图2B），在AML12细胞中也观察到类似结果（图2C）。为进一步验证HBsAg的产生，研究人员进行了免疫染色。如预期，AAV-HBV 1.2载体转导的HepG2细胞对HBsAg和HBV核心蛋白（HBc）均呈阳性（图2D）。与酶联免疫吸附测定（ELISA）结果一致，通过免疫染色可以在AAV-HBV 1.04载体转导的HepG2细胞中检测到HBsAg（图2D），Western blot进一步验证了HBsAg和HBc的表达（图2E）。在AAV-HBV 1.04载体转导的AML12细胞中也观察到了类似结果（图2F，G）。
由于pAAV-HBV 1.04载体缺乏完整的S基因区，这一结果表明在该模型中形成了另一种HBV转录模板，很可能是cccDNA。为验证这一假设，研究人员进行Southern blot分析，结果显示，在AAV-HBV转导的细胞中检测到了不同形式的HBV DNA。尽管由于HBV基因组插入片段大小不同，AAV-HBV 1.2和AAV-HBV 1.04的条带模式不同，但在两组中均可检测到cccDNA（图2H）。这些实验结果充分证明，AAV-HBV 1.04载体转导能够在细胞培养中支持HBV cccDNA的形成。
图2 AAV-HBV 1.04病毒载体转导细胞中HBV标志物的检测
（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）
3. HBV cccDNA形成机制
在HBV感染生命周期中，cccDNA主要通过松弛环状DNA（rcDNA，HBV-DNA在肝细胞内复制过程中的中间产物）转化形成，rcDNA通常来自输入病毒粒子的基因组和新形成的核衣壳的再循环。为研究该模型中cccDNA是否来源于rcDNA，研究人员使用抗病毒药物-核衣壳抑制剂（BAY41-4109和GLS4）和RNA逆转录抑制剂恩替卡韦（ETV）进行处理。结果显示，BAY41-4109和GLS4处理均导致HBc水平下降（图3A），BAY41-4109、GLS4或ETV处理均导致HBV DNA水平下降（图3B），而HBsAg水平保持不变（图3C）。由于在该模型中HBsAg只能由cccDNA产生，说明cccDNA的形成是通过其他机制。Southern blot进一步证实了这一结果（图3D）。
早期研究表明AAV感染会诱导宿主DNA损伤修复反应（DDR）。为了探究DDR酶是否参与cccDNA的形成，研究人员使用三种类型的DDR酶抑制剂：ATM抑制剂（KU-55933），ATR抑制剂（AZD6738, VE-821）和DNA-PK抑制剂（KU-57788）分别进行处理后发现，ATR抑制剂处理显著降低了HBsAg表达水平和cccDNA的形成（图3E），说明AAV-HBV 1.04病毒载体转导形成的HBV cccDNA是通过ATR介导的DNA损伤修复反应完成的。研究人员通过Southern blot进一步评估这些DDR酶抑制剂对该模型中cccDNA形成的影响，如图3E所示，与HBsAg ELISA结果一致，ATR抑制剂减少了HBV cccDNA的形成，而AAV-HBV伴随体不受影响（图3F）。