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AAV-Barcode快速筛选病毒定制服务（qPCR法筛选）

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AAV衣壳和表达框元件快速筛选

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）因其出色的组织特异性、低免疫原性、安全性和稳定性，已成为基因治疗领域极具潜力的病毒载体。由于不同衣壳AAV在组织亲嗜性上各有差异，因此选择合适的衣壳对于基因治疗效果的优化至关重要。此外，AAV表达框的优化也是决定基因治疗成败的核心环节之一。然而，传统的AAV衣壳筛选与表达框优化耗时费力、成本高昂，受实验批次间影响较大，导致结果的不确定性，从而难以实现系统性和标准化的优化流程。

因此，劲帆医药专为AAV设计了一段独特的DNA序列（Barcode），通过基因工程插至AAV基因组中，同时筛选针对各Barcode且经过扩增效率一致性验证的qPCR引物，通过qPCR检测Barcode表达水平来量化不同衣壳AAV的感染效率及表达框效能，为AAV优化提供标准化、高通量的解决方案。

优势

检测方法

1. AAV衣壳筛选

将候选AAV衣壳1:1（每种衣壳含有不同barcode）混合感染293T细胞或小鼠，取细胞或目标组织样并提取总RNA，通过qPCR检测不同衣壳AAVbarcode的表达水平，筛选最佳AAV衣壳。

2. AAV表达框优化筛选（启动子筛选为例）

将候选启动子（每种启动子对应一种特定的Barcode）与EGFP报告基因使用适合的衣壳AAV载体进行包装，然后将其1:1混合感染293T细胞或小鼠，取细胞或目标组织样并提取总RNA，通过qPCR检测EGFP及各启动子对应Barcode的表达水平，筛选出最佳启动子。

3. RNA提取及qPCR法检测

使用RNA提取试剂盒（需自备）提取细胞或组织样品总RNA，并用逆转录试剂盒（需自备）将1μg RNA逆转录为cDNA，然后通过EGFP及各Barcode引物进行qPCR检测病毒感染后是否表达对应mRNA，模板分别用AAV mix DNA/样品cDNA，反应按下表进行。

成分	体积（μl）
AAV mix DNA/样品cDNA	1
引物	0.4
qPCR mix	10
ddH₂O	8.2
总体积	20

4. 结果计算及分析

将qPCR实验所得Ct值对应填入下表，并按表中所示计算方式进行计算，最终的占比数值即为AAV mix中不同衣壳病毒相对感染效率，数值越大则表示该种衣壳AAV的感染效率越高/启动子表达效能越高。

病毒样品	AAV#1/ 启动子#1	AAV#2/ 启动子#2	AAV#3/ 启动子#3	AAV#4/ 启动子#4	…	AAV#9/ 启动子#9	AAV mix （总病毒）
引物	引物1	引物2	引物3	引物4	…	引物9	EGFP引物
AAV mix DNACt值	A	B	C	D	…	I	Y
样品cDNACt值	a	b	c	d	…	i	y
效率系数S	S=(2^－A+2^－B+2^－C+…+2^－I)/(2^－a+2^－b+2^－c+…+2^－i)
相对感染效率	2^A－a×S	2^B－b×S	2^C－c×S	2^D－d×S	…	2^I－i×S