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针对已确定的肿瘤突变谱的新抗原癌症疫苗是一种极具个性化的免疫治疗策略。黑色素瘤和胰腺癌的首批临床结果表明，个性化mRNA疫苗可诱导持久的新生免疫反应。这些疫苗包含预测的HLA-Ⅱ类和Ⅰ类表位，旨在诱导强大的CD4+和CD8+T细胞混合反应，这是能够成功治疗的关键因素。多项小鼠研究表明，CD4+T细胞对于CD8+T细胞的二次扩增以及通过常规1型树突状细胞（cDC1）启动T细胞毒性至关重要。

劲帆生物医药科技（武汉）有限公司（简称“劲帆医药”）创立于2022年，提供一站式病毒载体、蛋白和疫苗CRO/CDMO服务，拥有全球领先的规模化AAV制备专利技术平台及病毒载体/cGMP级蛋白/疫苗生产车间，致力于推进基因治疗药物、蛋白药物、治疗性疫苗更有效，更安全，更经济，更可及，赋能客户，造福患者。

文献解读

近日，来自德国癌症研究中心的研究团队在期刊《Molecular Therapy》上发表了题为“Neo-antigen tumor vaccination depends on CD4-licensing conveyed by adeno-associated virus like particles”的研究性论文，文章聚焦于AAVLP平台的新抗原疫苗研究，强调了CD4+T细胞“许可”对CD8+T细胞功能激活的重要性，以及显著的抗肿瘤疗效，为下一代新抗原疫苗的开发提供了新范式。

病毒样颗粒（VLP）在疫苗研究中应用历史悠久。它们是类似完整病毒的多蛋白结构，但不含病毒基因组。尽管VLP主要用于诱导强效抗体反应，并已应用于癌症预防、病毒感染以及急慢性炎症的临床实践，但其生物学特性和大小使其能被淋巴系统中的抗原呈递细胞（APC）摄取。腺相关病毒（AAV）是一种无包膜的单链DNA病毒，其复制依赖于腺病毒或疱疹病毒等辅助病毒提供基因组复制和病毒装配所需的基因。由于其对人体无致病性且能转导多种细胞类型，AAV已成为成熟的基因治疗载体。目前多项研究也探索了其疫苗用途。大多数策略基于基因免疫，即载体编码目标抗原，转导细胞后抗原通过MHC呈递以激发T细胞反应，或释放入循环从而诱导B细胞产生抗体，该策略已在多项小鼠临床前研究中得到验证。

1.SIINFEKL的AAVLP诱导CD8+T细胞反应并能预防肿瘤发生

研究人员通过将编码SIINFEKL肽的DNA序列引入AAV2衣壳蛋白的VR-Ⅷ或VR-Ⅳ环区，构建出衣壳修饰的AAV2载体（图1A）。在免疫健全的C57BL/6小鼠中，研究人员比较了不同注射途径、剂量和佐剂以确定最佳疫苗方案。通过将脾脏CD8+T细胞与经SIINFEKL肽脉冲的自体抗原呈递细胞（APC）共培养后，检查分泌IFN-γ和TNF-α的频率。结果发现，皮下胫骨前注射比尾根部注射和肌肉注射更能有效地诱导T细胞反应；且使用Montanide ISA51作为佐剂的效果优于c-di-AMP、CpG及其组合；并将5.0×10¹¹vg确定为有效剂量，可诱导显著的AAVLP-SIINFEKL疫苗反应，该反应在接种后3周达到峰值，随后逐渐减弱（图1B）。此时，AAVLP疫苗的性能优于单独的SIINFEKL短肽疫苗（图1C）。H2-Kb-SIINFEKL四聚体染色显示，接种后两周血液中已出现特异性CD8+T细胞，但此时脾细胞对脉冲APC无反应（图1D）。淋巴器官分析表明，四聚体阳性T细胞存在于接种小鼠的脾脏和血液中，但在腹股沟和腋窝淋巴结中未检测到（图1E）。为验证AAVLP疫苗的功能性效果，研究人员在接种后3周和10周通过皮下注射稳定表达卵清蛋白的B16F10黑色素瘤细胞攻击小鼠。两种情况下，AAVLP-SIINFEKL疫苗在6/7只动物中均显示出预防作用，抑制了肿瘤形成，与未接种或野生型AAV2接种小鼠相比显著延长了生存期（图1F、1G）。为测试广泛适用性并探索增强效力的方法，研究人员还利用AAVLP疫苗策略靶向病毒表位LCMV（淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒），并证实可在Ⅳ和Ⅶ环区同时插入SIINFEKL和Th1刺激肽J-ICBL。

 

图1 AAVLP-SIINFEKL疫苗通过CD8+介导的排斥反应预防肿瘤形成

（图片来源：Neukirch L, et al, Mol Ther., 2025）

2.新抗原AAVLP延缓肿瘤形成

研究选用B16F10黑色素瘤细胞系作为模型，因其具有高侵袭性且携带可作为新抗原靶点的频繁突变。根据H2-Kb等位基因的NetMHCPan 4.1结合亲和力排名，预测并选择了Kif18b(K739N)、Ddb1(L438I)、Golgb1(E2855D)和Snx5(R373Q)的肽序列作为疫苗候选，这些序列插入AAV2骨架后可形成完整病毒样颗粒(图2A)。研究依然采用上述预防性接种方案，研究人员比较了四种新抗原AAVLP复合物与等摩尔混合的4种新抗原21肽组成的多肽疫苗（作为比较基准）的效果，并在接种后3周注射肿瘤细胞。尽管脾脏CD8+T细胞反应仅对一种AAVLP-新抗原出现显著变化，但与PBS注射小鼠（阴性对照）相比，AAVLP-新抗原组显著延缓了肿瘤生长，而肽疫苗组未观察到该现象，导致AAVLP接种小鼠生存期显著延长（图2B）。安乐死时，研究人员对生长的肿瘤进行了解剖并通过流式细胞术分析其细胞组成。与PBS组相比，AAVLP治疗组检测到显著的CD3+T细胞浸润增加，但肽疫苗组无此现象（图2C）。进一步分析显示，CD4+和CD8+T细胞浸润有增加趋势，但未达到统计学显著性。值得注意的是，浸润的CD3+T细胞数量与接种后肿瘤大小呈负相关。

 

图2 新抗原AAVLP疫苗接种后可延缓肿瘤生长

（图片来源：Neukirch L, et al, Mol Ther., 2025）

3.AAVLP疫苗中的CD4+T细胞表位是抗原特异性CD8+T细胞反应所必需的

为探究CD4+T细胞反应对AAVLP疫苗效果的影响，研究人员在接种前使用CD4+耗竭抗体处理小鼠（图3A）。CD4+T细胞耗竭后，AAVLP疫苗方案未能诱导出可检测的脾脏CD8+T细胞反应（以SIINFEKL刺激反应为指标）（图3B）。而B细胞耗竭组（对照组）并未阻碍CD8+T细胞反应的诱导。在肿瘤攻击实验中，CD4+T细胞耗竭也消除了AAVLP疫苗的保护作用：CD4+耗竭小鼠的存活率与未处理的同品系小鼠相当，而使用同型对照抗体预处理的小鼠（阴性对照）对AAVLP免疫产生了预期的反应（图3C）。实验中所有动物在CD4+耗竭期间保持健康，未观察到自身免疫病迹象，这可能与CD4+调节性T细胞（Treg）的耗竭有关。研究人员进一步通过计算机模拟分析了AAVLP衣壳蛋白组中潜在的MHC Ⅱ类（Ⅰ-Ab）表位，这些表位可能作为CD4+T细胞受体的特异性靶点。利用NetMHCIIpan 4.0分析，鉴定了11个不同长度的肽作为结合亲和力排名（EL rank）最高的候选表位，命名为p1至p11（图3D）。衣壳序列中一个预测不结合肽被标记为阴性对照用于后续实验。有趣的是，11个候选表位中有10个不包含SIINFEKL蛋白的序列片段；p8虽包含四个属于SIINFEKL序列的氨基酸，但未出现在预测结合肽的核心区域。随后评估了AAVLP-WT或AAVLP-SIINFEKL接种诱导的CD4+T细胞对预测衣壳表位的功能性反应。接种后，分别检测到针对7个和4个肽的IFN-γ分泌细胞（图3E）。

 

图3 CD4+T细胞在诱导抗原特异性CD8+T细胞应答中的作用及AAVLP辅助表位的鉴定

（图片来源：Neukirch L, et al, Mol Ther., 2025）

4.整合MHC-Ⅱ表位可改善治疗性疫苗效果

为探究将AAVLP衣壳来源的CD4+反应诱导肽（即辅助肽），添加至此前无效的SIINFEKL肽疫苗中是否能改善效果。研究人员从验证实验中选择了四个潜在的MHC Ⅱ类表位肽，以等摩尔比例与SIINFEKL肽混合（混合比例与AAVLP衣壳中的表位比例相当）。在预防性肿瘤模型中，SIINFEKL+AAVLP辅助肽疫苗的效果显著优于单独的SIINFEKL疫苗，动物生存期延长，且效果与AAVLP-SIINFEKL疫苗相当。此效应可能由CD8+T细胞介导，因为存活小鼠脾脏中SIINFEKL特异性T细胞数量显著高于非存活小鼠，且存活小鼠中具有记忆表型的SIINFEKL T细胞比例更高。基于这些观察，研究人员进一步在治疗性模型中检验添加辅助肽（SHP）的疫苗效果：在黑色素瘤细胞注射后四天接种疫苗。结果显示，AAVLP-SIINFEKL治疗可减缓肿瘤生长并显著延长生存期，而SHP疫苗效果更佳（图4A、4B）。在SHP组中，10只小鼠中有3只未形成肿瘤，而单独的SIINFEKL治疗无效。在肿瘤注射后安乐死当天，SHP疫苗组小鼠脾脏和血液中SIINFEKL四聚体阳性T细胞数量多于单独的SIINFEKL肽疫苗组（图4C）。对SIINFEKL和SHP疫苗组小鼠肿瘤的全切片图像进行分析发现，SHP组肿瘤组织中浸润的CD3+T细胞比例更高，且这些T细胞从侵袭边缘向肿瘤中心渗透更深（图4D、4E）。为探究辅助肽替代对新抗原疫苗的影响，研究人员将SHP与四个排名最高的MHC Ⅰ类表位肽（新抗原肽）以等摩尔量混合，并在治疗性模型中接种小鼠（图5A）。结果显示，新抗原肽单独使用即可显著延缓肿瘤生长并延长生存期，添加SHP后效果略有提升，但未达到统计学显著性（图5B）。如前所述，SHP疫苗混合物诱导了更高的肿瘤T细胞浸润率和更深的浸润深度（图5C、5D）。

 

图4 AAVLP疫苗和替代肽疫苗的治疗效果

（图片来源：Neukirch L, et al, Mol Ther., 2025）

 

图5 治疗性辅助表位取代的新抗原疫苗接种后可减缓肿瘤生长

（图片来源：Neukirch L, et al, Mol Ther., 2025）

 

5.患者对新抗原疫苗接种的反应取决于MHC-Ⅱ表位

为测试MHC-Ⅱ表位在新抗原疫苗配方中的临床相关性，研究人员回顾性分析了所在科室六名患者的样本（表1）。这些患者在常规治疗失败后接受个性化新抗原疫苗作为末线治疗。研究根据患者个体HLA等位基因，通过生物信息学流程预测可被MHC-I呈递的新抗原表位从而制备个性化疫苗，并在患者上臂皮内进行疫苗接种，最初每两周进行一次，后期访视间隔延长。研究人员定期在疫苗接种前后采血进行功能性ELISpot检测。当至少一种突变肽的IFN-γ斑点计数超过内部检测对照且在疫苗接种前样本中检测不到时，则判定为阳性反应（图6c）。结果显示，在三名患者中观察到疫苗接种后反应，且反应次数差异较大（图6b）。研究人员回顾性分析了疫苗肽中是否存在每位患者的MHC-Ⅱ（HLA-DRB1）表位，并仅在应答患者中发现。然而，发现反应次数与检测到的表位数量并不相关。对个体患者的详细分析（图6c）显示，最初检测到高水平的新抗原特异性T细胞反应，这种反应一直持续到第10轮疫苗接种，但随着时间的推移，阳性IFN-γ计数数量逐渐下降。大多数反应是de novo（新）诱导的，除了患者#3中的一种肽，其反应性T细胞在疫苗接种前就较频繁，并且对非突变对照肽也可检测到反应。有趣的是，在患者#1接种第3次和第8次后以及患者#2整个治疗过程中测量的新抗原特异性反应，影响的肽序列本身并不携带MHC-Ⅱ表位。因此可以推断这些反应是CD8+介导的（图6d）。为了支持这一假设，研究人员继续对患者#2的体外刺激PBMCs进行了更详细的分析。该患者因可测量的反应下降和最终疾病复发而接受了调整后的疫苗。新疫苗完全由预测的基因融合肽产生的新表位组成。通过双色pMHC-Ⅰ多聚体流式染色分析检测到8个CD8+反应中有6个与疫苗相关。只有一个MHC-Ⅰ表位（MQKMESRHV-源自HD-Pep3187）似乎与疫苗肽中相应的HLA-DRB1表位存在序列重叠。其他检测到的表位在相同的疫苗序列中未发现相应的MHC-Ⅱ表位，例如源自HD-Pep3197的SLPSNWDYRY（图6e）。总之，该临床数据集支持了以下发现：新抗原疫苗诱导T细胞反应依赖MHC-II表位提供的CD4+T细胞辅助。

表1 患者特征详情

（表格来源：Neukirch L, et al, Mol Ther., 2025）

 

 

图6 新抗原疫苗接种后的患者反应分析

（图片来源：Neukirch L, et al, Mol Ther., 2025）

总结

本次研究提出并实验证明了一个基于AAV样病毒颗粒（AAVLP）平台的新抗原疫苗策略，强调CD4+T细胞对CD8+T细胞功能激活的重要性。研究显示，通过将CD4与CD8的新抗原表位共同嵌合于AAVLP中可以实现高效抗原递送、强力T细胞激活以及显著的抗肿瘤疗效。CD4+T细胞不仅提升了CD8+T细胞的扩增与杀伤能力，还通过影响树突状细胞功能间接增强抗原呈递效率。研究还进一步证明了缺失CD4+路径会显著削弱疫苗效力，强调了辅助性信号在疫苗免疫中的重要地位。总而言之，AAVLP作为一种高度可工程化、免疫原性强的疫苗平台，为下一代抗原疫苗的开发提供了新范式。