前沿导读

CAR-T细胞疗法的获批彻底改变了B细胞恶性肿瘤的治疗，然而，这类疗法在临床推广过程中面临一系列障碍，包括制造复杂、缓慢、成本高昂、细胞来源受限以及患者因病情进展而错失治疗机会。当前，体内基因工程提供了一种替代方案，该方法将基因治疗递送载体直接给予患者，实现体内细胞修饰（图1A）。递送载体涵盖病毒载体（如慢病毒）、脂质体或聚合物纳米颗粒，可递送多种遗传物质。无论采用何种载体，所有体内基因工程策略均面临核心挑战——将遗传物质精准递送至目标细胞。近年来，体内基因工程（尤其是CAR-T细胞领域）已从临床前概念验证阶段迅速发展至临床测试阶段。

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劲帆医药凭借多年在基因治疗载体和肿瘤免疫领域的研究经验，能够为CAR-T及其他细胞治疗研究者提供全流程服务，包括CAR分子设计、具有靶向性病毒载体的设计、CAR病毒制备、免疫细胞制备与表型检测以及体外和体内药效评价。

2025年7月，《Molecular Therapy》期刊发表了题为“Targeted in vivo delivery of genetic medicines utilizing an engineered lentiviral vector platform results in CAR T and NK cell generation”的研究论文。首次系统报道了通过设计VSV-G融合蛋白（Gen 2.1 Fusogen）与CD7结合蛋白的组合，实现对T细胞和NK细胞的特异性转导，并在人源化小鼠和食蟹猴模型中验证了体内生成CAR细胞、清除B细胞的治疗效果与安全性。

01 Gen 2.1融合蛋白的合理设计实现了载体的重定向

为实现遗传药物的体内特异性递送，研究人员利用VSV-G蛋白“结合”与“融合”功能相互独立的特性，基于其与天然受体LDL-R的晶体结构，通过计算机模拟识别出Q10和I182关键位点，并假设引入相反电荷突变（如Q10K或I182E）可破坏LDL-R结合而不影响融合活性（图1B）。实验中，构建包膜为不同突变型VSV-G的慢病毒载体，检测其对SupT1细胞的转导能力，发现Q10突变未能有效屏蔽LDL-R结合，而I182D/E突变显著降低了转导活性；进一步通过加入CD7结合子验证融合能力，结果显示引入CD7结合蛋白后，突变载体可恢复对CD7+细胞的剂量依赖性转导，效率接近野生型VSV-G（图1C）。最终对比发现，I182E突变在高滴度下非特异性转导更低，因此被选定为最优的“去靶向”突变位点（图1D、1E）。

图1 设计慢病毒载体实现靶向递送

（图片来源：Andorko JI, et al, Mol Ther., 2025）

02 Gen 2.1融合蛋白和CD7结合蛋白的包膜载体实现靶细胞特异性转导

为验证优化后的CD7结合蛋白的靶向性，研究人员使用CRISPR技术敲除SupT1细胞中的CD7基因，并对其进行转导实验。结果显示，携带Gen 2.1融合蛋白和CD7结合蛋白的载体无法转导CD7缺失细胞，而野生型VSV-G包膜的载体仍可高效转导，说明该平台的转导依赖于CD7的特异识别（图1F）。此外，该平台还展现出良好的通用性。研究人员构建了靶向CD7、CD4和CD8的scFv结合蛋白，并用于转导来自不同供体的PBMCs（外周血单个核细胞，免疫细胞）。结果显示，CD4结合蛋白选择性转导CD4+细胞，CD8结合蛋白转导CD8+细胞，而CD7结合蛋白可同时转导CD4+和CD8+细胞中的CD7+亚群（图1G、1H）。

03 INT2104特异性转导T/NK细胞并产生功能性CAR+细胞

研究人员基于CD7在T细胞和NK细胞中的特异性表达，开发了携带CD20 CAR的慢病毒载体INT2104，通过Gen 2.1融合蛋白与CD7结合蛋白的协同作用，实现对体内T细胞和NK细胞的精准转导（图2A）。体外实验表明，INT2104可有效转导激活的人PBMCs中的CD4+、CD8+ T细胞及NK细胞（图2B），转导效率与传统体外制备的CAR T产品相当；转导后的细胞与CD20阳性B细胞系（Raji、Daudi，图2C、D）共培养时，展现出强效的剂量依赖性杀伤活性，且该活性完全依赖CD20抗原的存在，证实了CAR介导的特异性识别（图2E）；此外，转导细胞可大量分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2等关键效应因子，且CAR+ T细胞的细胞因子表达水平显著高于CAR T细胞，进一步验证其功能活性（图2F-H）。这些结果共同表明，INT2104无需体外扩增即可直接诱导功能性CAR T和CAR NK细胞的生成。

图2 INT2104转导过程中生成具有功能性的CAR+细胞

（图片来源：Andorko JI, et al, Mol Ther., 2025）

04 评估INT2104转导B细胞的风险

无论CAR T细胞产品通过体外制备还是INT2104体内生成，B细胞非预期转导均会有安全性风险。为评估该风险，研究人员在健康供体分离的原代B细胞、套细胞淋巴瘤（MCL）/滤泡性淋巴瘤（FL）/慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者PBMCs及B细胞肿瘤系中测试INT2104转导潜力。结果显示：即使在高感染复数（MOI）下，健康供体原代B细胞也未发生转导（图3A）；测试的B细胞系（Nalmö, DB, VL51, JVM13, Recl）仅在超生理水平MOI时检测到微弱阳性（图3B），与GFP载体无法转导B细胞系的数据一致；MCL/FL/CLL患者的B细胞样本同样未见转导迹象（图3C）。

图3 评估INT2104转导B细胞的风险

（图片来源：Andorko JI, et al, Mol Ther., 2025）

05 INT2104转导的PBMCs可杀伤表达CAR20的B细胞

进一步研究非预期转导的CAR20+ B细胞是否仍可被INT2104转导的PBMCs杀伤。研究人员采用WT VSV-G转导人B淋巴瘤细胞系DB，使其表达CAR20和GFP或单独的GFP。将四名供体的INT2104转导PBMCs与上述DB细胞系共培养后，评估CAR介导的细胞毒性（图3D）。结果显示：INT2104转导PBMCs能剂量依赖性杀伤DB细胞，无论其表达CAR20和GFP或单独GFP（图3E）；共培养组存活的DB细胞中CAR+GFP+细胞比例较对照组有升高趋势（图3F），表明表达CAR20的B细胞仍可被INT2104生成的CAR20效应细胞杀伤。

06 静脉输注INT2104至人源化小鼠可生成CAR+ T/NK细胞并清除B细胞

随后，研究人员通过人源化小鼠模型（标准NSG-CD34与Hu-IL15转基因NSG）验证INT2104单次静脉注射效果：标准模型（图4A-F）显示，无论供体B/T细胞比例差异（图4B）或剂量如何，治疗组在第7天时外周血CD20+/CD19+ B细胞均显著下降（图4E），第21天显示完全清除且持续至第47天，同时血液（图4F）及脾/骨髓/肝（图4M）中均检出CAR+ T细胞（含CD4+/CD8+）；Hu-IL15模型（图4G-N）进一步证实NK细胞扩增（4.41-7.46%, 图4J）后，脾脏可定量检测CAR+ NK细胞（≈5%, 图4N），且两模型均实现B细胞清除（图4K）与CAR+ T细胞生成（图4L），全程无小鼠体重下降或死亡，以上结果充分证明INT2104可在体内持久生成功能性CAR T/NK细胞并彻底清除B细胞，且安全可控。