一项对猴的AAV基因治疗研究表明，整合后的载体可能驱动长期的转基因表达。许多正在进行中的基因治疗试验使用腺相关病毒(AAV)载体递送治疗性转基因，这些试验期望通过长期表达来实现预期的临床益处。然而，AAV基因组在患者体内的命运和转基因表达的动态尚不完全清楚。

近日，来自德国Noscendo公司的研究团队在《Nature Biotechnology》上发表了题为“Tracing the fate of AAV vectors in the body”的文章，系统性评论了来自宾夕法尼亚大学Greig研究团队关于AAV载体在恒河猴中的表达动态研究。作者Greig的数据对“AAV转基因的长期表达是由附加型载体（episomal vectors ）介导”的这一共识作出了新的看法，并提出持续表达是由整合基因组所驱动的假设。如果此假设在人体中得到验证，它可能会改变AAV载体的临床开发，从而实现最大的临床功效和安全性。要更好地了解AAV基因组在人类细胞中加工方式，以及如何优化这些载体的医疗应用，还需要进一步的研究。

AAV载体命运追踪

AAV载体具有安全性、有效性和长期转基因表达的记录，这使其成为在非分裂细胞中需要持续表达时的首选载体。多项血友病试验报告AAV转基因表达长达8年。两种AAV基因疗法Roctavian和Hemgenix已在欧洲和美国分别被批准用于治疗严重血友病A和血友病B。这两种产品都需要持续表达才能保持临床益处，并且已证明临床疗效长达3年。

然而，众所周知，AAV载体递送的转基因的表达动态在不同的研究和个体受试者之间存在差异。大多数临床和临床前研究显示，在治疗后的前6个月内会出现早期表达高峰，随后逐渐下降或显著减少，最后稳定。这种动态变化被认为受到多个因素的影响，如血清型、转基因盒设计、转基因的免疫原性和载体剂量。研究设计和测量转基因表达方法的差异阻碍了对这些因素的系统分析，特别是在大型动物和人类中。

一个基本的仍未解决的问题是AAV载体基因组在宿主肝脏分子水平上的命运，以及载体基因组动态如何影响转基因表达。2001年，在小鼠中进行的一项研究巩固了AAV载体仍然是游离的这一观点。该结果显示，在肝切除和和随后的肝再生后，肝脏中的转基因表达减少了约90%。由于染色体外基因组在细胞分裂过程中丢失，因此得出的结论是：附加体（episomes）一定是驱动长期表达的。目前还不清楚在小鼠身上的这种观察结果如何适用于大型动物和人类。一项关于自互补AAV（self-complementary AAV, scAAV）的研究发现，载体基因组分子加工存在物种差异，结果显示非人灵长类动物(non-human primates,NHPs) 的分子间重组频率高于小鼠。然而，对小鼠、NHPs和人类肝脏中超大AAV5-FVIII基因组的研究显示，在这三个物种中，在后期的酶消化中均存在环状附加体（circular episomes）片段。有趣的是，在人类肝脏中实现了高转导水平，但与所有患者转基因DNA和RNA水平并不一致。

尽管关于AAV在大型动物和人类肝脏中的分子命运的纵向研究很少，但最近的研究提供了一些有用的见解。已知AAV载体可以整合到宿主基因组中，但这种整合的程度仍在讨论之中。研究还表明，在NHPs和人源化小鼠模型中，整合的AAV可以采取大型串联结构的形式。串联体如何促进转基因表达尚不清楚。此外，越来越多的证据表明，持续存在的AAV基因组，无论是整合的还是游离的，都含有重排，这可能会损害基因表达盒的功能。

大型动物的纵向研究面临某些实际的限制，包括动物数量少、研究时间和测量次数的限制。Greig等人的这篇文章通过多种分子检测分析了多达4次连续的肝脏活检，研究了18只恒河猴在两年内的转基因表达情况(图1)。与NHPs研究中经常观察到的情况相比，这种综合方法使作者能够使用更少的动物，并且降低了转导和整合频率的个体间差异。除了测量转基因蛋白的表达动态外，作者还通过定量PCR、单核RNA测序和原位杂交评估了载体DNA和RNA的表达量和定位，并将这些与基于short-read和long-read的载体整合分析相关联。

图1 AAV基因组分析和转基因在NHPs肝脏中的表达

（图片来源：Zabaleta N and Gil-Farina I, Nat Biotechnol, 2023）

这些分析表明，载体基因组随着时间的推移而减少，即使是自体转基因，也伴随着转基因RNA的减少（图1）。基于序列的分析显示，在载体给药后2年内存在大量载体基因组重排和整合的串联基因组，其中10-50%代表完整的转基因序列。有趣的是，除了接受免疫原性转基因的动物外，载体DNA呈阳性的肝细胞百分比比含有载体RNA的肝细胞百分比高6-480倍。作者提出，附加型载体基因组可能发生表观遗传沉默，使整合基因组负责长期表达。然而，他们的数据并没有提供转录沉默的直接证据，而且转基因RNA呈阳性的肝细胞与含有载体整合的肝细胞之间的相关性本身就是一个薄弱的论据。

作为一项针对猕猴的研究，Greig等人的工作受到跟踪的动物数量和评估变量(如AAV血清型和转基因)的限制。作者提供了四种不同转基因的数据，但所有这些数据都是在少数动物中进行的测试，并且通常诱导了针对转基因的免疫反应，包括接受自我转基因的两名受试者之一。另一个关键挑战是，该领域缺乏对分析载体整合位点的方法进行系统的性能评估，以及区分游离基因组和整合基因组的准确方法。因此，作者的综合数据提供了一个全面的概述（分别从基于PCR和靶向富集的方法中检索，结合short-read和long-read测序），但仍然缺乏载体整合频率的定量读数。此外，表现出最高整合频率的动物并没有表现出最高的表达水平，反之亦然。这一系列问题阻碍了对整合基因组作用作出明确的结论，作者关于它们驱动长期表达的假设仍然是推测性的。研究还应该指出的是，其他NHPs研究报道了持续的转基因表达，以及载体基因组与转基因表达之间更好的相关性。然而，新的数据表明，AAV整合的问题不仅在安全性方面，而且从持续转基因表达水平的角度来看，都是令人感兴趣的。

总结

总的来说，长期研究AAV载体在大型动物和人类中的命运对于提高AAV基因治疗的安全性和有效性至关重要。虽然该领域主要将AAV整合作为安全性参数进行评估，但整合对疗效的影响仍未得到充分探讨。进一步研究介导长期表达的载体形式，开发合适的模型和工具，将是未来临床进展的重要基础。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-023-02047-5