AAV分析表征

2023年3月8-9日，ARM（the alliance for regenerative medicine，再生医学联盟）和USP（the united states pharmacopeial convention，美国药典委员会）共同举办了为期一天半的AAV分析表征研讨会，涵盖了与AAV质量相关的各种主题。本期将分为上中下三篇，上篇和中篇为大家详细介绍了该研讨会中“空/完整衣壳表征”和“效力测试（potency assays）”主题内容，下篇将为您介绍“载体基因组滴度测定和剂量”主题内容。

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优化AAV分析方法以提高AAV基因疗法的安全性、有效性和产量（上）

优化AAV分析方法以提高AAV基因疗法的安全性、有效性和产量（中）

载体基因组滴度

载体基因组滴度(vg/mL)通常用于确定AAV基因治疗产品的临床剂量。载体基因组滴度表示每mL产品中含有目的基因组的纯化后载体颗粒的物理浓度。准确的AAV基因组滴度是临床前和临床研究剂量确定的基础。

载体基因组滴度测定方法

目前常用的基因组滴度检测方法为qPCR（quantitative polymerase chain reaction）和ddPCR（digital droplet polymerase chain reaction），这些定量技术都有其独特的工作流程和优缺点，因此需要根据具体项目（program-specific）或具体阶段（phase-specific）选择合适的测定方法。

CDMO领域的一位高管分享了一个从qPCR到ddPCR策略转变的例子，以配合客户的项目计划。在可比性研究中，qPCR和ddPCR两种方法得出的AAV2和AAV8载体基因组滴度结果相当。此外，在经多次重复分析后，发现ddPCR具有良好的中间精密度(＜6% CV)。另一位演讲者也分享了一个例子，qPCR方法检测得到的的载体基因组滴度始终比ddPCR检测的结果高约2倍。

图1 不同检测方法的流程图

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

图2 qPCR和ddPCR优缺点比较

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

从载体基因组滴度到量化载体基因组完整性

单重 PCR（simplex PCR）方法，如qPCR和ddPCR，提供的基因组完整性信息有限。由于PCR本身会扩增小片段，qPCR或ddPCR测定的滴度可能会高于全长基因组。这会存在一定的误差，因为全长基因组代表了目的基因的有效荷载。

图3 单重PCR方法过高评估全长基因组

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

一位开发人员提出，载体基因组完整性可能成为重要的CQA（critical quality attribute），但他指出的这一点仍有争议。多重dPCR检测，每个反应有更多的靶点，可以更仔细地观察基因组完整性。在载体基因组的开始和结束各有一个靶点的双重检测是多重dPCR最简单的例子。然而，双重检测仍有可能检测到单个片段，这就需要充分了解样本中的靶点分布。三重和四重PCR检测法虽然在开发、鉴定和验证方面越来越复杂，但可以更详细地了解目标序列的完整性。

图4 通过四重dPCR了解载体基因组完整性

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

事实上，这位开发人员介绍了一种四重PCR检测方法，该方法目前已被开发用于定量AAV载体基因组，还可以添加其他靶点。该方法在基因组全长百分比范围内具有良好的重复性、精密度和线性。他建议，基因组完整性定量的结果可用于指导工艺开发，甚至可以确定上游或下游工艺中富集特定片段群的不同步骤。

综上所述，多重dPCR检测能够更好地表征产物，并且有助于工艺优化，从而提高衣壳内全长病毒基因组的产量。多重检测通常可降低成本，因为联合检测可避免对每个潜在靶点进行单独检测。对全长包装基因组进行富集可提高效力，从而降低给药剂量，提高患者安全性。目前需要更详细的研究来确定基因组完整性和效力之间的真正相关性。

一名开发人员在利用ddPCR技术验证载体基因组滴度时观察到较大的变异性。这促使他的公司将SEC-MALS技术作为一种稳健、灵敏和自动化的基因组滴度检测方法进行研究。SEC-MALS技术将尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography,SEC）与多角度光散射（multi-angle light scattering,MALS）以及在线浓度检测器相结合，可以检测多种AAV特征(例如聚集度、杂质、空满衣壳比和DNA含量)，也是一种基因组滴度检测方法。

SEC-MALS并不是一种可以完全取代ddPCR的工具，而是可以帮助更快地鉴定批次，并为工艺开发人员提供有关生产运行情况的更好反馈。

图5 ddPCR和SEC-MALS的优缺点比较

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

载体基因组滴度测定的监管考虑因素 

FDA对确定AAV基因组滴度所选择的具体检测方法没有限制，但在启动临床研究之前，应对该检测法进行验证。这需要证明该方法的线性、准确性、范围、精密度、灵敏度和专属性。早期研究阶段的一般监管期望包括：(1)加标回收率约为预期值的80%-120%；(2)中间精密度CV≤15%；(3)使用无关AAV载体作为对照(而不仅仅是缓冲液)。此外，FDA建议开发人员花大量时间了解AAV基因组滴度测定的变异性原因(例如试剂、人员、设备)。