2023年3月8-9日，ARM（the alliance for regenerative medicine，再生医学联盟）和USP（the united states pharmacopeial convention，美国药典委员会）共同举办了为期一天半的AAV分析表征研讨会，涵盖了与AAV质量相关的各种主题。本期将分为上中下三篇，上篇详细介绍了该研讨会中“空/完整衣壳表征”主题的内容，中篇将为您介绍“效力测试（potency assays）”主题内容。

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效力（potency）的定义

效力（potency）是指一种物质产生特定生物效应的特殊能力。因此，效力是任何AAV基因治疗产品的关键质量属性（critical quality attribute，CQA）。不同机构对效力的定义略有不同，但都有一个共同的主题：效力必须与产品的相关生物学特性联系起来，应作为其生物活性的定量指标进行报告，并应通过适当的实验室测试进行测量。

 

图1 不同监管机构对效力的定义

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

AAV效力测试的目的和要求

效力测试（potency assays）可以体现药品的作用机制（mechanisms of action），对产品放行检测、稳定性检测和可比性研究至关重要。明确某种产品的效力，必须具体了解它是如何在体内发挥作用的，而基因疗法中AAV携带的转基因通常具有复杂或不明确的作用机制。在早期阶段，开发人员应尽可能多地了解转基因产品。在确定指导效力测试设计的生物活性时，开发人员应考虑：临床前数据、尽可能地使用与人类相似度较高的动物模型、总结现有的历史经验、现有的参考材料和对照。2011年，FDA发布了题为《Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products》的行业指南。【编者更新：FDA已于2023年12月发布了新的指导草案，题为《Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products》，该文件强调须采取更全面的方法来确保整个产品生命周期中的效力。】 尽管该指南并非专门针对AAV基因治疗产品，但开发人员可以利用EMA和FDA发布的指南以及其他相关指南，采取切实可行的方法进行效力测试开发。目前许多指导文件是将细胞治疗和基因治疗主题结合在一起，该研讨会的参会者也指出，未来的指南应分别论述这些主题。

 

图2 EMA和FDA发布的适用于AAV基因治疗产品效力测试的监管文件

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

 

效力测试可反映生物级联中的多个points（如AAV颗粒转导至细胞内、转基因表达和功能活性）。在早期开发阶段，只需明确AAV颗粒转导细胞的能力以及DNA翻译为mRNA和蛋白质的能力即可。在开发后期，有必要建立一种可证明预期基因产品生物学功能的效力方法，并且方法需要验证，以确保其稳健性和控制性，这样就有可能减少matrix assays的数量（如有可能取消转导和基因表达检测）。

在产品开发期间，方法验证工作的目的是证明其稳健性，并从线性（linearity）、范围（range）、专属性（specificity）、精密度（precision）、准确度（accuracy）等不同方面来证明。线性和范围通常通过产品特异性标准物质或参考物质来确定，而专属性可以通过比较药物的活性与阴性对照的活性来确定。精密度可以通过重复操作来确认，并可由不同操作员在不同日期使用不同设备等来寻找某种分析方法运行中的变异性。准确度通常将认可的参考值与测量值之间的差异进行报告。

 

图3 各验证指标的定义

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

效力是药品生命周期的一部分

效力测试或assay matrix的概念化和开发始于药品生命周期的早期，并随着产品走向商业化而成熟。在产品开发的每个阶段，与FDA就效力测试的期望保持一致至关重要。在pre-IND阶段使用的效力测试通常还不合格，主要用于筛选和表征候选药物。这些方法可能限于体外基因表达检测或动物模型中的表达和生物分布检测。在IND阶段，开发人员需要向FDA提供关于药物物质和药物产品质量控制策略的信息，包括与效力相关的策略组成部分。对于早期阶段的研究，效力测试预计是合格的，适用于药品的批放行，但目前的规格可能比较宽泛。到关键临床试验启动时，预计会有一个经过验证的强度（strength，vg/mL）检测方法，这样开发商就能证明分析方法已准备就绪，可用于商业化。随着开发人员提交BLA申请，效力规格也会越来越严格。监管机构最终期望规格范围缩小到足以检测出有意义的效力差异（例如次效批次），并且验证报告应包含在BLA中。获批后，经过验证的效力测试可用于鉴定新的参考标准，证明随着生产规模扩大而产生的工艺和场所的可比性，并解决在淘汰旧试剂或设备、引进新试剂或设备时可能出现的“方法漂移（assay drift）”问题。

 

图4 药品整个生命周期的效力测试开发

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

效力测试的开发需要时间和金钱，通常是药物开发中的限速步骤。一些赞助商选择尽早投入到功能性生物效力测试的开发中，而另一些赞助商可能会等到候选药物产生显著的临床疗效时再投入到效力测试的开发中。这两种策略都可能奏效，但开发商和监管机构普遍认为，尽早开始效力测试的开发是最好的方法。合格的效力测试可能有助于在概念验证阶段确定候选药物，并可能排除不太可能有效的候选药物（例如，通过显示启动子太弱而无法产生足够的表达，从而影响病程）。同样，功能测试可以表明蛋白质设计可能不适合恢复功能（例如，为适应AAV衣壳而截短的cDNA可能会消除蛋白质的关键功能）。如果开发人员获得了加速审批途径（如获得了RMAT认定或获得了突破性疗法认定），那么尽早投入到效力测试的开发中尤为重要。

随着产品开发时间的推移，效力测试方法也会发生变化。接下来的几个部分将讨论这些潜在的变化：从体内检测转向体外检测、建立多种效力分析方法（potency assay matrix）以及优化该matrix以提高效率。

体内与体外效力测试

在产品开发的早期阶段，体内效力测试可用于测定活性或基因表达。这种方法可对效力进行定性检测，但由于对人力、成本和时间的要求较高，以及对动物模型的依赖，在开发的后期阶段变得不切实际。随着药品越来越接近商业化，体外效力定量检测通常更受青睐。体外检测可以测量相对于特征明确批次的效力。此外，体外检测通常比体内检测更快、更可靠，并且能最大限度地减少使用动物进行检测，这符合欧盟的“3R”指令，即替代（replace）、减少（reduce）和优化（refine）动物的使用。

 

图5 体内和体外效力测试的优缺点

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

建立多种效力分析方法

在AAV基因疗法开发的早期阶段，通常会采用符合目的的多种效力分析方法（potency assay matrix），以评估影响其作用机制的多种属性。在传统matrix方法中采用的检测手段可检测AAV的转导（测量传递到细胞的DNA，如TCID50）、mRNA表达量（如RT-PCR）、蛋白表达量。蛋白表达量检测方法可包括但不限于：Western blotting、ELISA、流式细胞术、毛细管电泳等。此外，通常还会根据转基因的预期生物活性，开发一种用于检测蛋白质功能的正交定制检测方法。这些定制检测方法的开发、鉴定和验证非常耗时，但可能是衡量真正生物学相关性的最有意义的方法。

 

图6 用于检测效力的符合目的的matrix方法

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

在一些开发人员和监管人员看来，证明产品的功能活性就足以证明蛋白表达已经完成。值得注意的是，FDA的要求常常被开发人员曲解，会将对证明整个生物级联过程的控制的要求与对完整potency assay matrix的要求混淆。FDA的代表重申，如果已经建立了定量功能检测方法，并证明其具有足够的稳健性和控制性，则该机构不要求使用potency assay matrix。然而，开发人员注意到，某些国际监管机构可能仍然希望使用正交试验来证明从转导到表达再到发挥功能的整个生物级联过程。在这种情况下，assay matrix中可能会出现多种方法，每种方法否可能有不同的验收标准，这就需要投入大量的时间、人力、物力和财力。

优化potency assay matrix

一般来说，开发人员会努力简化或“优化（prune）”potency assay matrix，使其成为批次放行所需的较少数量的测定。一些开发人员表示希望取消TCID50作为批次放行所需的检测项目，因为TCID50的波动性较大，而且不能反映AAV的真正作用机制。据推测，通过证明其他效力测试与TCID50相关，最终可实现这一点。一位赞助商分享了一个案例，说明如何成功地利用高内涵成像（high-content imaging）、多属性体外检测法（multi-attribute in vitro assay）同时测定感染活性和表达，以消除TCID50作为批次放行所需的检测项目的作用。这种多属性检测法的开发和鉴定工作在产品开发初期（pre-IND）与功能效力测试的开发同时启动。最终，与TCID50相比，这种检测方法提供了更高的通量、更少变化的感染活性测量（并且更能反映AAV的作用机制），且不增加成本。这种检测方法与相对效力直接相关，并且在较宽的温度范围内，比TCID50更灵敏，是一种更具稳定性的检测方法。理想情况下，可以开发出一种能在单一检测中测定感染活性、表达和功能的检测方法，作为一种“golden”效力测试方法。

测量效力的监管考虑因素

效力应反映出某个产品的属性，因此FDA强调，效力测试的要求将根据具体情况而定。监管机构希望开发人员控制药品功能所需的所有生物活性。特定效力测试的论证必须包括能证明该检测方法得到良好控制的数据。如果控制不充分，FDA将要求进行更多测试，并可能要求进行正交试验。但是，如果对功能测试进行了充分的控制，也将被判定为对与生物活性有关的上游产品属性进行了控制。FDA对效力测试的认可取决于赞助商提供的数据。测定相对效力（即相对于控制变异性的表征良好的标准或参照批次）似乎在业界最为常见，也是FDA的一贯要求，但如果有足够的数据支持，该局也会考虑测定绝对效力的方法。本质上，开发人员的责任在于说服FDA（或任何卫生当局）如何表征他们的AAV基因治疗产品。

FDA意识到，开发和优化效力测试需要时间。此外，用于评估效力的新分析技术也在不断发展，监管机构对AAV的理解和对其效力的期望可能也在以不同的速度发展。在一些国家，监管机构继续要求将TCID50作为效力matrix的一部分。因此，尽早与监管机构就效力测试的预期进行接触都是关键。为获得FDA（或其他卫生部门）的重点反馈，提交的材料应明确定义检测（assay）和控制（controls），提供可用数据，尽可能简洁，并提出相关问题。归根结底，效力测试的预期不仅应由监管机构来推动，也应由开发人员来推动，因为他们要仔细评估给患者服用的药物是否能够产生预期的生物效应。