在进行基因治疗给药之前，评估患者体内的预存的AAV抗体水平是基因治疗效果和安全性的一个重要考虑因素。据估计，大约30-60%的人群体内有预存的中和抗体，这些抗体可能会抑制AAV载体对靶细胞的转导，从而阻碍转基因表达，也可能引起严重的免疫反应。来自Pfizer、Laborp和佛罗里达大学的Suryanarayan Somanathan和Barry J. Byrne等人，在期刊《Molecular therapy》上发表了题为“Binding and neutralizing anti-AAV antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy”的综述，系统地概述了检测患者血浆或血清中AAV抗体的方法，回顾了AAV抗体对基因治疗疗效、安全性和临床试验受试者筛选的影响，并提出了减轻预先存在的AAV抗体对患者影响的策略。

1. AAV抗体概述

中和抗体（Neutralizing antibody, NAb）与AAV病毒结合，干扰病毒与靶细胞表面受体结合，干扰病毒进入细胞体内，从而降低病毒转导效率影响基因治疗的有效性。同时AAV与AAV中和抗体形成抗体抗原复合体，也可能引起一系列的免疫反应，影响基因治疗的安全性。

 

图1 AAV中和抗体抑制载体转导和转基因表达的机制

（图片来源：Schulz M et al, Mol Ther, 2023）

AAV抗体血清流行率取决于多种因素，如AAV血清型、年龄、检测类型和地理区域。其他影响因素还包括患者的健康状况（健康或患病）以及是否使用了免疫抑制剂，如利妥昔单抗和环孢素。

 

图2 以血友病A和B人群为例，AAV抗体血清流行率在AAV血清型和地理区域存在差异

（图片来源：Schulz M et al, Mol Ther, 2023）

2. 预存AAV抗体对基因治疗疗效、安全性和临床试验受试者筛选的影响

在动物和人体中进行的AAV基因治疗研究表明，即使滴度较低，预先存在的AAV NAb也能限制或完全阻断转基因的表达。在动物研究中，已发现在接种了AAV8 NAb的AAV8处理小鼠中，FⅨ水平无法检测到；而在AAV2 NAb滴度仅为1:3.8的AAV2处理小鼠中，观察到FIX表达减少96%。然而，研究发现预先存在的NAb的影响因血清型而异。在恒河猴的研究中，AAV8 NAb＞1:5时，几乎完全组断了转导。同样，在另一项恒河猴研究中，AAV8 NAb滴度为1:5时，FIX的表达完全消失。相反，一项研究调查了AAV9 Abs对恒河猴转导效率的影响，结果显示，AAV9 TAb滴度达1:400时也不会阻断肝脏基因转移。

在人体上的研究显示，一名体内预先存在的NAb滴度为1:17的血友病B患者接受了AAV2载体治疗，FⅨ表达水平降低。在另一项研究中，科学家们评估了AAV（Spark100）基因治疗的效果，其结果显示，与NAb滴度较低（＜1:1）的受试者相比，AAV-Spark100 NAb滴度为1:1的受试者FⅨ活性较低。

目前普遍认为抗体介导了先天免疫和B细胞及T细胞依赖的免疫反应。例如，预先存在的抗体可以与AAV载体结合并引导它们进入次级淋巴器官，被抗原呈递细胞吸收。这可能会改变AAV载体的生物分布和清除率，可能导致靶细胞分布减少和/或炎症。

中和或非中和IgM/IgG抗体被认为会与循环载体形成免疫复合物，可通过经典途径激活补体系统。补体系统的激活可导致血栓性微血管病（thrombotic microangiopathy, TMA）综合征和肾损伤。在一项针对DMD患者的AAV基因治疗研究中，三名受试者在接受高剂量载体（2E14vg/kg）治疗后出现补体激活。然而，由于所有患者在基线时TAb和NAb均为血清阴性，因此TI和TAb检测都不能预测这些病例中的补体激活。在初次接受AAV基因治疗的naïve患者中，可能会出现补体激活等先天免疫反应，这与病毒载体剂量有关（常见于＞1E14vg/kg高剂量）。在AAV基因治疗给药后的几天内，新生IgM抗体的形成可能比基线抗体状态更能预测补体激活和类似TMA的不良事件。随着AAV基因治疗的发展势头日益强劲，正在通过加强患者检测、修改临床试验的患者入组资格和调整免疫抑制方案等方式，来更好地了解和管理与宿主免疫反应相关的不良事件。

并非所有临床试验都将AAV血清阳性作为排除标准。etranacogene dezaparvovec在血友病B患者中的Ⅲ期临床研究中使用AAV5载体，并使用未经验证的临床试验检测方法对患者进行治疗，未考虑该患者的AAV NAb状况。与未检测到预先存在的中和抗AAV5抗体的患者相比，检测到预先存在的中和抗AAV5抗体≤1:678的患者的平均FⅨ活性较低。

3. AAV抗体的检测方法

在进行基因治疗给药前，已经开发了几种检测AAV抗体的方法。到目前为止，转导抑制（transduction inhibition, TI）检测和总抗体（total antibody, TAb）检测已用于常规临床试验。这些检测通常使用患者血浆或血清样本，为简便起见，本文将这些样本统称为血清样本。

（1）TI检测

TI检测通常称为NAb检测，用于检测NAb和非抗体中和因子对AAV介导的报告基因表达的抑制程度。TI检测采用基于细胞的方法，使用与特定基因治疗相同的衣壳，但包含“报告”基因便于检测。报告载体构建需要以与相应的基因治疗载体类似的方式生产和纯化，确保两者具有可比的分析指标（空:完整衣壳比率、完整基因组百分比、杂质），否则可能会影响检测结果。在接种靶细胞之前，将患者血清进行梯度稀释并与AAV报告载体预孵育。经过一段时间的孵育使靶细胞转导并表达报告基因后，通过测量报告基因表达量的减少来评估AAV中和滴度。中和滴度通常被定义为能使AAV转基因表达量减少到特定程度（如≥50%）的最高血清稀释度，或根据抑制曲线推断得出的稀释度（ID₅₀）。TI检测不仅可检测是否存在NAb，还可检测抑制转导的非抗体中和因子。非抗体中和因子可能包括小分子、先天免疫激活剂和脱落的AAV受体。

 

图3 TI检测和TAb检测的原理

（图片来源：Schulz M et al, Mol Ther, 2023）

AAV报告载体通常包含提供方便且灵敏的转导检测基因，例如绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）、β-半乳糖苷酶或荧光素酶，而不是治疗性转基因。为了评估针对AAV的中和活性，需要在存在和不存在待测样本的情况下检测报告基因的表达，并使用阳性对照（positive-control, PC）和阴性对照（negative-control, NC）样本。检测低滴度NAb的能力可能取决于报告基因、AAV衣壳和检测方法的设计等具体特性。多项研究报道，与使用GFP报告系统的TI检测相比，使用荧光素酶（luciferase）报告系统的TI检测能更灵敏地检测到NAb。

用于TI检测的细胞类型多种多样，包括HEK293、HeLa和Huh7细胞系，其中以HEK293细胞系最为普遍。不同的AAV衣壳血清型对这些细胞系的转导效率各不相同。转导效率低的衣壳会导致较低的转基因表达水平，因此需要更高的MOI（感染复数，即病毒颗粒与靶细胞的比例）或转导增强试剂才能达到可检测的转基因表达水平。然而，使用较高的MOI会改变衣壳抗体的化学计量，从而影响检测结果。其他可能影响检测结果的因素包括样本基质、样本起始稀释度、靶细胞数、检测孵育时间和温度、所用血清量以及补体蛋白的热失活。肝素等试剂的使用也可能通过与蛋白聚糖的剂量依赖性、竞争性结合影响HeLa或HEK293细胞的转导。与样本采集和处理相关的因素也可能影响结果，包括样本采集设备/试管、样本完整性(溶血、脂血)、样本处理和储存条件。

（2）TAb检测

TAb检测可检测所有与AAV衣壳结合的抗体，无论这些抗体是否具有中和（抑制）活性。TAb检测通常是在微孔板中加入AAV载体（空或满）或AAV肽段。传统的TAb检测平台之间存在很大差异。抗原捕获试验是利用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）或电化学发光试验（electrochemiluminescence assay, ECLA）评估直接与衣壳结合的AAV抗体。针对抗原捕获试验的抗原体类型检测依赖于使用适当的试剂区分Ig的类型。或者，可以使用带有标记的衣壳作为二级试剂的桥接试验来检测所有与衣壳结合的抗体类。

选择AAV衣壳衍生的试剂是TAb检测中的一个重要考虑因素。这些试剂在不同的检测中各不相同，可选择完整的AAV病毒颗粒、空衣壳或衣壳蛋白。衣壳蛋白（或蛋白片段）可能无法代表衣壳表面的所有相关表位或构象表位，因此推荐使用完成的衣壳。此外，空衣壳与完整衣壳相比具有不同的电荷，这可能会影响它们与抗体的结合亲和力。

（3）AAV抗体检测的cutoff值、筛选滴度cutoff值、读数和质量控制

TI和TAb检测可使用梯度稀释的患者样本进行半定量检测，也可以使用预先确定好的稀释倍数进行定性检测。在后期的临床研究中，通常采用梯度稀释来半定量报告AAV抗体滴度。

截断值（cutoff）是一个特定参数，当样本稀释倍数超过这个值时，就会被报告为中和活性阳性。cutoff值在不同的方法之间存在差异，通常会设置一个固定值表示样本为阳性（比如50% TI）。患者资格的筛选滴度cutoff值根据预先确定好的稀释倍数（比如≥1:4）来定义。这些参数通常是通过比较naïve动物与血清阳性动物的转导情况来建立的。然而，由于大型动物研究队列（例如狗、猪和猕猴）通常规模较小，而且动物数据向人类的转化往往受到限制，因此确定适当的筛选滴度cutoff值相当复杂。图4显示了一种半定量TI检测（其原理也同样适用于TAb检测），以1:3梯度稀释和50%抑制为cutoff值。

 

图4 半定量TI检测的读数

（图片来源：Schulz M et al, Mol Ther, 2023）

TI和TAb检测的质量和功能评估需要PC和NC样本。通常选择略高于筛选滴度cutoff值作为PC滴度。PC可由多克隆或单克隆血清型特异性AAV抗体组成，并可使用市售专有试剂，以便进行跨产品数据比较。血清型特异性或交叉反应PC试剂用于表征分析性能参数，包括灵敏度、精密度、分离度和稳健性。选择PC试剂时应谨慎考虑，因为有些单克隆PC可能具有严格的血清型特异性，而其他PC（包括多克隆PC）则会与多种衣壳发生交叉反应。NC通常由多个NAb阴性个体或naïve动物的血清汇集而成，用于监测检测性能，也可用作稀释剂，调节信号强度。具有独特特异性的单克隆抗体也可作为NC，例如，AAV6小鼠单克隆抗体（anti-AAV6 mouse monoclonal antibodies, ADK6）可用作AAV9检测的NC，反之，AAV9小鼠单克隆抗体（anti-AAV9 mouse monoclonal antibodies, ADK9）可以用作AAV6检测的NC。开发NC的主要挑战是预先存在的抗体的高流行率，因此需要一个确认步骤来排除抗体阳性样本。

（4）检测方法比较

TI和TAb检测之间缺乏标准化，因此目前无法准确比较检测性能和临床实用性。TI通过检测NAbs和nNAbs因子来直接测量转导抑制，但需要具备专门的实验室并配备专业的检测人员,且难以开发成商业化的试剂盒。TAb相比TI检测，其实施过程更简单，并有可能开发成适用于多个临床实验室的检测试剂盒，其中抗原捕获试验可用于检测特定的免疫球蛋白同种型；但TAb无法直接测量转导抑制，由于其存在多种不同的平台和格式选项，使得TAb检测实现标准化变得困难，并且可能会检测到一些低亲和力的交叉反应性抗体，从而增加了数据分析的复杂性。两种检测方法的详细优缺点见表1。

表1 TI与TAb检测的比较

（表格来源：Schulz M et al, Mol Ther, 2023）

 

 

一些研究表明，某些血清型（比如AAV1、AAV3B、AAV5、AAV8）的TAb和TI检测结果之间存在合理的相关性，但其他血清型（比如AAV9、AAVrh74、AAVDJ）则不存在。一项对健康志愿者使用TAb和TI检测AAV5的研究发现，一部分人在一种检测中呈阳性，而在另一种检测中呈阴性。一般来说，在NAb滴度较高的样本中，TI和TAb检测的结果会一致（阳性）。为了解决TI和TAb检测结果不一致的问题，一些AAV基因治疗试验提出了双检测筛选策略，以确定TAb和NAb均为阴性的个体，这些个体更有可能获得预期的基因治疗效果。

4.伴随诊断

与AAV基因治疗相关多项监管指南建议申办者考虑同时开发诊断检测来筛查预先存在的AAV抗体。如果该检测被认为对安全性或疗效至关重要，且入组的基因治疗临床试验受试者获得了良好的治疗效果，则可将此类检测归类为伴随诊断（companion diagnostic, CDx）。

CDx的上市申请和AAV基因治疗的生物制剂许可申请应协调一致，以支持同时获得上市许可。对于CDx与AAV基因治疗的共同开发，申办者必须明确该检测方法的用途及其各自的风险和益处，还需要明确该检测方法与治疗结合使用时，哪些患者群体将从中受益。理想情况下，CDx和基因治疗应在早期同时开发，这样该检测就可以用于早期临床研究，从而避免日后可能进行的桥接研究。

针对AAV基因治疗的CDx检测的监管环境正在不断发展，并且在某种程度上可以解释：对于已获得FDA、EMA和日本厚生劳动省批准的Onasemnogene abeparvovec，美国和欧洲使用实验室开发的方法来检测AAV TAb滴度，而日本则使用CDx。对于已获得EMA批准的Valoctocogene Roxaparvovec，根据欧洲体外诊断指令（In Vitro Diagnostic Directive, IVDD），可将CE标记的TAb检测作为CDx。对于已获得FDA批准的etranacogene dezaparvovec，上市后FDA的要求之一是验证一种灵敏、准确的TI检测方法，用于检测滴度达1:1400或更高的AAV5 NAb。

5.克服预先存在的AAV抗体影响的策略

目前，有相当一部分体内存在NAb的患者会被排除在基因治疗临床试验之外，因此正在探索克服这一挑战的各种策略。这些方法大致可分为基因治疗相关方法（包括直接给药到靶器官、高剂量给药克服预存抗体、预先递送空衣壳中和预存抗体、修饰衣壳/使用不同的AAV血清型或工程化AAV）和治疗前方法（使用免疫抑制药、血浆透析、使用IgG切割酶和Anti-FcRn抗体），详见表2。

表2 减轻患者预先存在的AAV抗体影响的策略

（表格来源：Schulz M et al, Mol Ther, 2023）

 

总结

在进行系统性基因治疗给药之前，准确、可靠地检测AAV抗体是确保疗效和安全性的重要考虑因素。保守的临床试验受试者筛选标准（过于严格的筛选滴度cutoff值）可能会将患者排除在可能改变或挽救生命的治疗之外。相反，过于宽松的标准可能导致治疗无效或产生潜在的安全隐患。目前，尚无确定临床相关抗体水平的通用方法。TI或TAb检测均可使用，两者各有利弊。广义上讲，TI检测侧重于与临床相关的转导抑制参数，因此能直接检测可能影响AAV基因治疗结果的抗体，但还需更多的专业知识和努力才能使其成为临床常规检测方法。相比之下，TAb检测既能检测NAb，也能检测非NAb，而且操作性和自动化程度较高。在为特定AAV基因治疗制定生物分析策略的过程中，应根据特定的载体构建、载体剂量、给药方式、疾病适应症、患者群体和患者群体规模来考虑这两种检测类型的特点。

参考文献：

1.Salabarria SM, Corti M, Coleman KE, et al. Thrombotic microangiopathy following systemic AAV administration is dependent on anti-capsid antibodies. J Clin Invest. 2024 Jan 2;134(1):e173510. doi: 10.1172/JCI173510.