2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了voretigene neparvovec-rzyl（VN）（Luxturna）的上市，这是一种基于腺相关病毒（AAV）载体的基因疗法，用于治疗已确认存在双等位基因RPE65突变的相关视网膜变性疾病，这是美国和欧盟（2018年）首次完全批准的针对遗传性疾病的基因疗法，Luxturna的临床开发项目可作为其他创新疗法的典范。

2024年6月，来自美国Spark Therapeutics公司的Kathleen Z. Reape研究团队，在期刊《Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine》上发表了题为“Trial by “Firsts”: Clinical Trial Design and Regulatory Considerations in the Development and Approval of the First AAV Gene Therapy Product in the United States”的综述，文章以Luxturna项目为例，讨论了加快先进疗法开发过程中的考虑因素以及经验教训，特别是在临床和监管方面的见解。

1.Luxturna项目临床开发计划

Luxturna临床项目共招募43名RPE65突变患者，其中41名患者在三项临床试验中接受了不同剂量的治疗：一项剂量递增的Ⅰ期研究，对视力较差的眼睛进行单侧给药；另一项Ⅰ期研究在前一次研究测试的最高剂量下，对另一只眼睛进行单侧给药，距离首次给药至少已有一年时间的随访；以及一项开放标签、随机、对照的Ⅲ期研究，其中最初被随机分配到对照组的个体在为期一年的观察期后可以转入干预组。所有在Ⅰ期或Ⅲ期临床试验中至少接受过一次Luxturna剂量的受试者，都将进行长达15年的随访。此外，由于在Ⅲ期关键性试验中采用了新的主要终点（多亮度移动性测试MLMT），研究人员还验证了MLMT的可靠性和性能。

为更好地理解与RPE65突变相关的遗传性视网膜营养不良患者的临床过程，还进行了一项回顾性疾病自然史研究。但由于这是一种罕见疾病，描述其自然进展的历史数据有限，且当时基因检测技术相对较新，远未普及。此外，许多可用的历史数据由于使用了多种非特异性的临床描述而变得较为混淆。

2.Luxturna项目临床试验设计方案

Luxturna项目的Ⅲ期临床试验是评估安全性和有效性的关键研究。从Ⅰ期临床试验中获得的安全性数据使得Ⅲ期试验的入组标准得以扩大，包括视力损伤程度较轻的患者以及年龄低至3岁的儿童患者。Ⅲ期临床试验方案，需要克服一系列临床和监管挑战，包括对照药物的选择、观察期的长短以及主、次要终点的选择，所有这些都在一个患者数量极少、缺乏自然病程数据的超罕见疾病的背景下进行。因此，随机对照试验设计似乎是Ⅲ期临床研究的最佳选择（如图1）。

 

图1 Luxturna项目Ⅲ期临床试验设计以及长期随访设计

（图片来源：Reape KZ et al，Cold Spring Harb Perspect Med. 2023）

研究人员通过2:1随机化方案和允许对照组交叉接受干预，减轻了对照组负担。此外，在1年观察期结束时，所有对照组的受试者都获得了接受干预的机会，两次试验结果保持一致，这为临床试验项目避免了额外研究的同时，还提供了确认性证据。另一个讨论的重点是非干预性观察期的最佳时长。与RPE65相关的视网膜营养不良是一种进行性疾病，任何可能的治疗干预的过度延迟都会导致进一步的视力损伤，且这种损伤是不可逆的。根据非临床发现以及两项Ⅰ期试验的观察结果，预计早期治疗效果显著，且在给药后30天即可显示出改善。鉴于该病症的进行性特点及其对儿科患者的影响，相关研究人员建议观察期设为6个月。最终试验设计纳入了一个为期1年的观察期，以评估安全性和有效性，这与大多数传统关键性临床试验设计一致。

RPE65在视网膜色素上皮（RPE）细胞中表达，是参与调控视觉周期和11-顺式视黄醛再生的关键酶（如图2）。尽管视觉周期的生物化学过程受到破坏且视力逐渐损伤，但视网膜的解剖结构在很长时间内得以保留，正是这种保留为基因治疗等方法提供了依据。

 

图2 RPE65在视觉周期中的作用

（图片来源：Reape KZ et al，Cold Spring Harb Perspect Med. 2023）

与RPE65相关的视网膜营养不良的患者，即使在正常的日间光照下行动困难，并且在昏暗环境中定位和导航能力严重受限。2011年，FDA咨询委员会召开会议，讨论应用于治疗视网膜疾病的细胞和基因治疗试验。会议得出结论，认为需要为特定疾病及其临床缺陷量身定制新的终点指标，还建议使用多种工具来评估视觉功能和功能性视力，并考虑患者报告的与日常活动相关的结果。根据FDA咨询委员会的建议以及与监管机构的讨论，确定Luxturna项目的Ⅲ期临床试验的主要终点应该是功能性视力的评估，并将与RPE65突变相关的视网膜营养不良相关的特定临床缺陷（即夜盲症）考虑在内。视觉功能评估也被作为次要终点和探索性终点，包括全视野光敏度阈值(FST)测试、视力（VA）和视野（VF）。其他探索性终点包括基于问卷的患者及家长报告的视觉功能评估，以及由低视力康复专家在家庭环境中进行的基于社区的功能性视力评估。选择疗效终点的目的是以可量化的方式评估受试者在干预前后的视觉功能和功能性视力。这种创新与传统方式的结合，为评估视神经萎缩（Luxturna）的疗效提供了一种严谨的方法。无论是在研究层面还是在个体受试者层面，所有来自不同类型终点的发现都是一致的并相互支持，证明了显著的治疗效果，并为新的终点提供了可信度。

3.确定新的临床试验终点

MLMT评估方法要求受试者在不同的光照条件下，在限定时间内独立且准确地完成导航任务（如图3所示）。所选择的光照范围和特定光照水平代表了日常生活中常见的照明环境。事实上，在MLMT的设计和完善过程中，研究人员使用测光仪在一系列室内外环境中测量了共七种真实世界的光照水平，从最低的1lux到最高的400lux。虽然照度等级代表了真实世界中的光照情况，但其间隔并不一致。Ⅲ期临床试验中测试的七种光照水平分别为1lux、4lux、10lux、50lux、125lux、250lux和400lux。根据评分算法，发起人认为在一个或多个光照水平上的改善才具有临床意义。回顾MLMT的构建过程，为了更容易地解释测试结果，光照水平在整个范围内可能应该被等间隔分隔（即每个水平之间的半对数梯度）。然而，数据的统计分析依赖于干预组与对照组之间光照水平的相对变化，这使得从一个水平到下一个水平的光照等级变化幅度意义不大。此外，由于大多数受试者光敏感改善显著（超过一个光照水平和/或改善至最低光照水平），因此光照水平之间变化的小幅差异对疗效结论的影响可忽略不计。

在进行MLMT测试前，在临床试验现场建造专用测试室时，研究人员都咨询了照明工程师，并在天花板上安装了永久照明设备，同时特别注意尽量减少移动路径上的阴影或其他伪影。为进一步标准化MLMT照明，在每次测试运行之前，都会使用经过校准的测光仪在路径上的五个不同点测量光照水平。研究人员总共开发出12种不同的标准化路径，并以随机方式呈现，以最大限度地减少任何潜在的学习效应。每条路径都有相同数量的障碍物、转弯和障碍。另外还设置了一个“练习”MLMT路径（不用于测试运行），以帮助受试者熟悉如何进行测试。

 

图3 MLMT测试和光照水平

（图片来源：Reape KZ et al，Cold Spring Harb Perspect Med. 2023）

每次测试运行都被录像以供评估和打分。由中央独立评分小组（经低视力专家培训）观看测试运行视频，并按照评分协议进行评分。两名评分员分别对每个视频进行评分，出现分歧时，再由第三名评分员进行裁决。视频经过滤处理，被测试的光照水平对观看者来说并不明显。视频以随机方式呈现，评分员对临床试验现场、研究访问、受试者和分组情况均保持匿名。作为额外的质量控制措施，在整个研究过程中，随机选择了上一季度10%的视频进行重新评分。在Ⅰ期和Ⅲ期临床试验、移动性测试验证研究（MTVS）（见下文）以及长期随访研究（LTFU）中，对超过4000个视频进行了评分。统计结果显示，MLMT所有评估组成部分（如完成时间、错误次数）之间的一致性非常高。

一项在54名儿童和成人中进行的独立性研究（MTVS）（其中28名有视力低下和遗传性视网膜疾病史，26名视力正常者）被用于确定MLMT的性能特征，特别是MLMT是否能够检测出患有IRD的受试者随时间变化的功能性视力变化，以及它是否能够区分视力正常者和视力低下者。此外，该研究还定义了MLMT性能与视觉功能指标之间的关系。在为期一年的观察中，有1/3视力低下的受试者表现出视力下降。这一发现表明MLMT能够敏感地捕捉到视力变化，但在Luxturna Ⅲ期临床试验开始时并未知晓。验证研究还表明，MLMT能够区分视力低下人群和视力正常人群，并且在低视力人群中，能够识别出一系列视觉性能水平并追踪随时间的推移视力下降的表现。MTVS的另一个关键点是，它允许定义MLMT性能与VF和VA之间的关系。具体来说，即观察到一个截断效应：VA＞0.5logMAR（或20/63 Snellen当量）的受试者在移动性测试中表现及格，而VA较差的受试者则表现不佳。对于Goldmann VF也观察到了截断效应，VF＜500度的受试者在移动性测试中表现不佳，而VF＞500度的受试者则通过移动性测试。

MLMT也存在两个主要缺点：一是对于非常年幼的和学步儿童来说过于复杂。在Luxturna Ⅲ期临床试验中，能够理解并正确执行MLMT的最小年龄是4岁；二是存在“天花板效应”，有多名受试者在进入Ⅲ期临床试验时就能在4lux（即第二低的光照水平）下通过测试。然而，总体而言，MLMT是一种重要且可靠的测量功能性视力的工具，它直接解决了与RPE65突变相关性视网膜营养不良患者相关的一个主要临床缺陷（即夜盲症）。目前这项新的终点指标正在不断完善，已被FDA作为在针对IRD进行基因治疗的指导文件（U.S. FDA 2020）中的范例。

4.确定次要终点和探索性终点

FST被选为第一个次要终点指标。与在MLMT中观察到的变化类似，FST也显示出每只眼睛的光敏感度都有所改善。此外，FST的动态范围能够延伸到远低于1lux的光水平，从而区分那些在MLMT上光水平改善一个等级并可能遇到“天花板效应”的受试者。在对照组中光水平改善一个等级的受试者，其FST的相应增益远低于干预组中MLMT光水平改善一个等级的受试者。MLMT主要被设计为一种研究工具，并未打算将其纳入一般临床实践中实施。由于更传统的评估指标（FST）与MLMT之间存在良好的相关性，因此在商业环境中使用FST来确认与保险公司达成的“业绩付薪”协议中的临床改善。新型的一次性疗法在报销方面存在困难，但是FST与MLMT之间的相关性将是推动报销策略创新和临床实践改进的关键因素之一。由于新型疗法的开发周期较长，研究人员还需要预见未来支付方的需求，并在开发计划中纳入足够的卫生经济措施。

针对罕见病的临床研究，审慎的做法是纳入广泛的终点指标，这些指标的选择应基于疾病的潜在病理生理学和干预措施的作用机制，并在必要时同时包含传统评估方法和更新颖的方法，期望的是主、客观终点指标的结合使用。来自Ⅰ期临床试验的观察结果可用于完善研究工具和评估方法，以及为关键性研究选择疗效终点。

5.FDA咨询委员会建议

在临床试验研究结果出来后，继续与监管机构、研究人员、患者及其家属保持沟通依然十分重要。FDA为Luxturna项目召开了咨询委员会会议，于2017年10月召集了一批外部专家，对临床项目、安全性和有效性研究结果进行审查，并就批准事宜提出了非约束性建议，会议讨论产生的建议后被纳入Luxturna说明书。通常，产品的标签会反映其Ⅲ期临床试验中代表的条件和患者人群。但在本例中，外部专家考虑到该病的罕见性，并建议扩展标签语言，使用超出临床试验中设定的标准，以便灵活识别符合条件的患者并扩大患者人群。

会议中一个主要的讨论点是使用光学相干断层扫描仪（OCT）测量的视网膜厚度。在Ⅲ期临床试验中，规定视网膜厚度必须大于等于100μm。这是一个替代指标，用于指示视网膜的存活能力，但并非活细胞的特定指标。咨询委员会的讨论的重点是“现实世界”的情况。例如，视网膜厚度为95或99μm的患者在接受治疗时是否真的面临更大的风险？如果是这样，他们是否应该被排除在接受Luxturna治疗的范围之外？讨论者建议保持灵活性，因此标签语言表述为“患者必须具有由治疗医师确定的活视网膜细胞”。另外，咨询委员会还讨论了Luxturna治疗的最佳开始年龄，考虑到视网膜生长和细胞分裂的时间，以及AAV载体DNA的稳定性，因此允许1岁及以上的儿童进行治疗是合理的（这都包含在Luxturna说明书中）。

6.自然史研究

自然史研究是一种计划性的观察性研究，旨在追踪疾病的发展过程，目的是识别与疾病发展和结果相关的因素（如人口统计因素、遗传因素、环境因素等）。了解罕见疾病的自然史对于药物开发的各个阶段的信息提供和规划都至关重要。作为Luxturna临床开发计划的一部分，研究人员对70例与RPE65突变相关的视网膜营养不良患者的数据进行了自然病史回顾性研究。

研究主要分析了VA和VF两个重要参数。年龄作为时间的替代指标，将所有个体数据点纳入分析。截面数据显示，通常情况下尽管VA明显受损，但在生命的前十年中相对稳定；大约在15-20岁时，VA开始下降，20岁后迅速下降。到18岁时，这群人中超过一半符合美国“法定盲”标准。VF也观察到类似的变化，其下降过程比VA更线性和渐进，在大约14-15岁时，该参数的受损程度开始超过美国的“法定盲”标准。自然史的研究结果表明，疾病进展呈对称性，且大多数患者会出现夜盲症。近3/4（74.3%）的受试者报告了在导航和行动能力方面存在障碍，这为选择MLMT作为Ⅲ期临床试验的主要疗效终点提供了数据支持。

在这70例确诊双等位基因RPE65突变的患者中，报告了超过20种不同的临床诊断，其中一些患者有多种临床诊断结果。此外，共观察到56种不同的RPE65突变。特异性RPE65突变与临床诊断、发病、严重程度或进展率之间不存在明显相关性。因此，进行基因检测和分子诊断变得尤为重要，它能帮助医生更准确地识别能从Luxturna基因治疗中受益的患者，从而为他们提供更加个性化和有效的治疗方案。

 

总结

Luxturna临床开发计划对罕见病和/或基因治疗临床试验具有普遍的适用性。对于首次人体试验采取保守态度是非常有必要的。这包括仔细界定Ⅰ期临床试验的受试者人群，然后在安全性和初步疗效得到确认后，在Ⅲ期临床试验中扩大纳入标准。随着可能适合基因治疗的疾病范围不断扩大，开发和验证新颖、具有临床意义和可量化的终点指标将成为临床试验的重要组成部分。另外，临床数据的衔接性也很重要。在Luxturna临床试验中，所有终点指标都能相互印证，数据总体在生理学上是有意义的，为干预措施的有效性提供了额外支持。申报人员应仔细考虑这些因素，并尽早听取该领域专家、研究人员、患者及其家属以及监管机构的意见，将有助于制定强有力的临床试验计划，加速临床试验进程，为患者提供更多更先进的治疗方法。