腺相关病毒（AAV）载体在临床上已经被证明可用于治疗基因疾病。目前已有几种基于AAV的基因治疗方法获得上市批准，包括Luxturna(用于治疗视网膜疾病)、Zolgensma（用于治疗脊髓性肌萎缩症SMA）以及Elevidys（用于治疗杜氏肌营养不良症DMD）等。随着针对血友病的新型肝靶向AAV基因治疗药物的出现，基因治疗在肝病学界引起了广泛关注，肝脏作为基因治疗的靶标越来越被认可。

2024年2月，来自英国Blizard医学研究机构的Graham R. Foster团队，在期刊《Journal of Hepatology》上发表题为“Adeno-associated viruses for gene therapy-clinical implications and liver-related complications, a guide for hepatologists”的综述，文章中研究人员重点介绍了基于AAV载体的基因治疗方法，阐述了这一具有广阔前景的技术和在血友病研究中的显著成功，并特别关注了治疗过程中肝并发症及其在日常临床实践中的管理。

亮点

AAV基因治疗的应用：其安全性和有效性已经得到了验证，被越来越多地用于遗传性疾病的治疗，包括血友病。

AAV基因治疗副作用导致的肝炎：最常见的是短暂性的转氨酶升高，但通常不会对肝脏造成长期损害。

AAV基因治疗导致肝炎的病因：目前尚不清楚确切病因，研究揭示可能与先天性和获得性免疫反应相关。

对血友病患者的影响：AAV基因治疗导致的肝炎可能会降低转基因表达有效性，但在某些情况下，通过免疫抑制剂治疗可以恢复。

治疗策略：对于AAV基因治疗导致的肝炎，目前推荐采用在注射前后需要服用免疫抑制剂抑制肝炎，同时需要监测治疗效果，如果未能恢复转基因的表达，则应及时停止免疫抑制剂的治疗。

长期影响：AAV载体引入的转基因表达减少可能与DNA转录减少有关，影响是否是可逆的还需要进一步研究证实。

跨学科合作：肝病学家和血友病专家之间的密切合作至关重要。他们需要共同制定治疗方案，监测治疗效果，并及时调整治疗策略以最大化患者利益。

基因治疗——将遗传物质引入患者体内以改变基因或蛋白质表达从而获得治疗效果，在过去几十年里已经成为一个越来越受关注的研究方向。在血友病基因治疗研究领域，腺相关病毒（AAV）载体在递送机制上已被证明是受欢迎且有效的（见图1），欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）在过去几年中已批准了多种基于AAV的治疗方法（见表1）。

 

 

图1 针对血友病的肝靶向AAV基因治疗机制

（图片来源：Mücke MM et al，J Hepatol，2024）

表1 目前（文章发表时）获批的AAV基因疗法，及其在Ⅲ期临床试验中报告的肝脏不良事件

（图片来源：Mücke MM et al，J Hepatol，2024）

 

AAV转染的病毒学和机制

腺相关病毒（AAV）属细小（20nm）病毒科，呈二十面体结构，相比其他病毒非常稳定。AAV存在多种亚型，由于它们与受体的相互作用不同，因此具有组织嗜性差异。重组腺相关病毒（rAAV）的首次描述可追溯到1989年。从那时起，已有研究人员通过包装含转录调控元件（增强子/启动子序列）、目的基因和转录终止元件（例如多聚腺苷酸化序列）的基因表达盒，对AAV载体进行工程化改造。末端反向重复序列（ITRs）是仅保留的野生型病毒序列，其功能是介导载体基因组的包装并增强载体基因组稳定性。由于rAAVs无法在体内复制，降低了它们突变的能力，因此成为单次静脉注射后能够实现长期转基因表达的安全载体。AAV载体可以在哺乳动物细胞（如HeLa或HEK293）或昆虫细胞（如Sf细胞系）中进行制造。其中，昆虫细胞系统生产的AAV载体浓度较高，符合人类临床给药的要求。

AAV血清型之间不同的衣壳构象导致了特定的组织嗜性（主要靶向肝脏），这可以在临床环境中被利用或修改，以帮助转基因递送至靶标细胞。细胞内转运过程中，载体基因组从胞内体中逃逸，进入细胞核在细胞核中衣壳脱壳，载体基因组在细胞核内合成第二条DNA链，并且这些双链序列中的大多数（>99%）会形成单体和附加体，转基因能够长期表达主要归功于附加体。其中影响AAV转导效率的因素主要是载体摄取、胞内体逃逸、细胞核中单链DNA的衣壳脱壳。此外，涉及宿主机制的多个过程会参与治疗性蛋白的定位、表达和分泌。因此，宿主因子的个体表达可能会影响基因治疗应答水平，导致显著的个体间差异。

rAAV整合进宿主基因组的概率非常低。然而，确实有一小部分AAV载体（约1/1000个细胞）会发生整合。迄今为止，接受AAV基因治疗的患者中，尚无明确的证据表明AAV在恶性肿瘤生成中发挥了致病作用。虽然AAV载体的免疫原性较低，但免疫反应仍可能干扰其持续表达。过去接触过野生型AAV会引发中和抗体，从而影响基因递送或导致转导细胞被免疫系统攻击。rAAV输注入体内后，会引发强烈的体液免疫反应，产生高滴度的抗AAV中和抗体，可能阻止再次进行基因治疗。因此，AAV基因治疗目前被视为一次性治疗，该领域仍需要开发创新方法以提高其成功率，未来是否能实现重复给药还有待观察。

针对血友病的肝脏靶向的AAV基因治疗

血友病是一种X染色体隐性遗传性出血性疾病，导致凝血因子Ⅷ（FⅧ，即A型血友病）或凝血因子FⅨ（血友病B）缺乏。重度血友病患者需要每周静脉注射数次因子浓缩物以防止自发性出血（尤其是关节出血）和由此导致的关节病变。对于A型血友病患者，使用Emicizumab（一种FⅧ模拟抗体）进行皮下注射治疗可以延长治疗间隔。然而，由于关节腔内持续出血，接受了这些治疗后的患者仍会随着时间的推移而出现关节病变。血友病是一种单基因疾病，因此基因治疗尤其具有吸引力。此外，FⅧ或FⅨ水平的微小增加就会大幅减少出血事件（重度血友病<1IU/dl，中度血友病1—5IU/dl），血浆水平为5-40IU/dl已被视为轻度血友病，出血事件风险较低，增加至这一水平通常被视为具有临床意义。其遗传转录本较小，可以包装在AAV载体中，并且可以通过测量血浆中的因子水平来轻松评估基因表达。

2006年，在一项针对B型血友病的首次临床研究中，通过肝动脉输注AAV2的基因治疗，结果发现FⅨ表达显著增加，但仅能实现短期应答。五年后，一项基于AAV8的静脉输注基因治疗实现了FⅨ的长期表达，达到正常水平的2—11%。实现在不需要预防的情况下，出血事件显著减少。由于大多数临床研究处于Ⅰ期或Ⅱ期，纳入的患者数量较少，且采用非随机化设计，因此可参考数据仍然有限。

目前，两项Ⅲ期试验（分别针对A型血友病和B型血友病）的结果已经公布，这两种药物（Valoctocogene roxaparvovec和Etranacogene dezaparvovec）均获得批准用于治疗血友病：

GENEr8-1是一项开放标签、单臂、多中心研究，研究对象为无预先存在的抗AAV5抗体或血友病因子Ⅷ抑制物病史以及正在接受常规FⅧ预防治疗的重度A型血友病成年男性患者。患者接受单次输注Valoctocogene roxaparvovec（AAV5-hFⅧ-SQ，6×10¹³vg/kg），并随访52周。主要终点为输注后第49—52周期间因子Ⅷ活性的基线变化。总体而言，共134例患者接受了输注，其中132例为人类免疫缺陷病毒阴性，hFⅧ活性增加了41.9IU/dl（p<0.001），出血事件减少了83.8%（p<0.001）。所有患者至少发生一次不良事件（AE），22例发生严重不良事件（SAE）。115例（85.8%）患者报告了丙氨酸转氨酶（ALT）水平升高，并使用免疫抑制剂（主要为糖皮质激素）进行治疗，其中96.2%的事件在数据截止时得到解决。两名患者ALT水平升高较为严重，需要静脉注射甲基泼尼松龙。基于该试验公布的数据，Valoctocogene roxaparvovec于2022年在欧洲获得批准（其在美国FDA的上市申请也已于2023年4月获批），最近发表了一项更新分析，研究了该基因治疗2年后的安全性和有效性：结果显示hFⅧ活性持久增加并且出血减少，同时未出现新的与治疗相关的严重不良事件或安全性信号。

HOPE-B是一项开放标签、单剂量、单臂、多中心研究，研究对象为重度或中重度B型血友病成年男性患者，这些患者在研究前接受了常规FⅨ预防治疗。在至少6个月的观察期内监测出血/因子Ⅸ使用情况后，患者接受单次静脉注射Etranacogene dezaparvovec（AAV5-PdFⅨ，2×10¹³gc/kg），并再随访5年。主要终点为给药后26周和52周的因子Ⅸ活性以及52周后的年化出血率（ABR）。总体而言，共54例患者接受了输注，结果显示，FⅨ活性从基线迅速增加，6个月时最小二乘均数为36.2%，18个月时为34.3%（均p<0.001）。在滴度达到678之前，未发现预先存在的中和抗体与滴度之间的相关性，但一名患者在滴度为3212的情况下也未产生反应。与FⅨ预防治疗相比，该基因治疗52周后的ABR降低了64%（p=0.0002），出血事件减少了77%（p<0.0001）。未报告与治疗相关的严重不良事件，37例患者报告了与治疗相关的不良事件，9例患者出现肝酶升高，根据方案接受了类固醇治疗。所有患者在第26周前停止使用类固醇，且因子Ⅸ活性保持在轻度范围内。目前Etranacogene dezaparvovec在美国和欧洲都已获得批准，用于治疗B型血友病。

AAV基因治疗后引起ALT升高机制

肝脏是体内参与蛋白质和生化物质合成的主要器官之一，它已成为转基因表达的重要靶向器官。大型动物和人类的研究表明，肝脏靶向的AAV载体递送是可行的，并且能够实现持续的转基因表达。然而，肝脏安全性是一个关键的考虑因素。最近，在血友病患者的临床研究中发现大多数接受基因治疗的患者都被检测出肝酶升高。

AAV基因治疗后暂时性转氨酶升高的确切机制尚不完全清楚。值得注意的是，接受治疗后，B型血友病(FⅨ在其正常起源部位肝细胞中表达)患者的肝脏炎症比A型血友病(通常在窦状细胞中产生FⅧ，现在在肝细胞中产生)患者少，这表明异位蛋白表达可能会增强炎症反应，也有可能是因为FⅧ蛋白本质上比FⅨ蛋白更难折叠和分泌。目前正在临床试验中测试的其他基因治疗研究（见表1）也报告了肝副作用，但目前明确的机制细节或见解较少。在ALT升高时，从基因治疗受试者中获取的肝脏活检可能对于进一步揭示相关机制是必要的，但尚不清楚何时应进行这些活检。当前，研究人员已经提出了许多假设机制，包括免疫介导和细胞应激诱导的肝细胞损伤。

由于AAV载体容量有限（约4.7kb），因此，在A型血友病基因治疗中使用了较短的BDD-FⅧ转基因。然而，BDD-FⅧ蛋白容易发生错误折叠，并可能积聚在内质网（ER）中。事实上，已在肝细胞中证明BDD-FⅧ的过度表达会诱导未折叠蛋白反应，引起内质网应激并最终导致细胞凋亡。多个研究小组也报告了在动物模型中，由于AAV-BDD FⅧ基因治疗而产生了未折叠蛋白反应。重要的是，在这些临床前研究中，增强的细胞内应激并未显示与肝酶升高直接相关，这在一定程度上削弱了细胞内应激是ALT升高的主要致病因素的假设。目前，该领域在人体中的研究还较少，并且在这个阶段，还不能排除未折叠蛋白反应在AAV相关的转氨酶升高中起作用的可能性。

另一种假设的机制是，这些患者的ALT升高是由衣壳介导的免疫反应触发的。在通过肝动脉输注AAV2-FⅨ的B型血友病患者中，发现FⅨ的表达特别短暂，并且报告了肝酶的短暂升高。转氨酶的升高与CD8⁺ T细胞对AAV衣壳中特定序列的反应有关。然后，AAV转导的肝细胞在将AAV衣壳抗原呈递给MHC-Ⅰ复合物后，可能会被具有细胞毒性的T细胞靶向并消除。在另一项临床研究中，六名接受静脉输注AAV8-FⅨ而未接受免疫抑制治疗的重度B型血友病患者中，有两名接受了最高载体剂量的患者报告了ALT值升高。这两名患者均开始接受类固醇治疗，此后转氨酶恢复正常，而FⅨ水平保持不变。目前认为，在许多接受治疗的患者中，免疫介导的肝细胞损伤被认为在治疗后肝炎中起重要作用。由于肝炎可能与因子表达减少有关，而免疫抑制治疗有时可逆转这种减少，因此临床实践和许可指南均支持在发生肝损伤的患者中使用免疫抑制治疗。重要的是，要注意这种方法暂未接受过随机试验的检验。由于早期报告了免疫抑制在治疗后肝炎患者中的益处，因此制定了限制载体剂量的策略，并在后续临床试验中出现ALT升高的情况下定义了免疫抑制方案。尽管糖皮质激素是这类治疗方案的主要成分，但反应各不相同，且导致ALT升高的确切机制尚不完全清楚。到目前为止，临床前动物模型（小鼠或非人灵长类动物）在预测免疫原性和随后的肝炎方面已被证明是不准确的。此外，在使用AAV9载体治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的两项临床试验中，均报告了类似的ALT升高，这可能与该载体对肝脏的强组织嗜性有关。

许多临床前研究也将先天免疫系统与这一重要炎症反应联系起来。DNA中的未甲基化二核苷酸CpG基序可以作为病原体相关分子模式，通过激活Toll样受体9（TLR9）启动免疫反应。在基因治疗载体的构建中，这些潜在的致病编码序列通常通过不同的密码子修饰策略来最小化，因为研究表明这些序列可能是引发炎症和基因表达降低的关键因素。最近，一项临床试验揭示了TLR9激活在血友病患者中作为引发抗衣壳细胞毒性T细胞反应的重要触发因素。在该试验中，除一名患者外，所有患者的长期转基因表达均失败。这名患者IL-6受体基因中存在功能多态性，这与常规促炎信号的中断有关。导致基因治疗相关转氨酶升高的先天性和获得性免疫反应之间的相互作用细节仍有待阐明，但很可能两者都在一定程度上起作用，且影响程度可能取决于宿主。

ALT升高的临床表现及处理策略

在GENEr8-1试验中，大多数患者在治疗期间均出现ALT升高（85.8%）。表2详细描述了ALT升高和糖皮质激素使用的情况。AAV输注后，ALT升高的中位时间为第8周，但也有报道称在输注后1周即出现早期ALT升高。大多数情况下，ALT升高较为轻微（61.9%为1级），15.7%和8.2%分别为中度和重度。约80%的患者以每天60mg的剂量口服泼尼松或泼尼松龙，并在至少8周的时间内逐渐减少剂量。值得注意的是，由于ALT事件经常多次发生（75名患者发生事件＞1次），该试验中每位受试者接受糖皮质激素治疗的中位持续时间为230天，并且与糖皮质激素治疗相关的不良事件（AE）很常见（72%的患者），包括痤疮（29%）、失眠（21%）、库欣样表现（15%）和体重增加（15%）。如果糖皮质激素有禁忌症、可能导致不可接受的副作用或疗效不足，则会使用其他免疫抑制剂。这种情况发生在29.1%（n=39）的患者中。然而，在这些患者中，有13人接受了其他类型的类固醇治疗（见表3；布地奈德（n=6），中位日剂量为每位参与者9.2mg/天；甲泼尼龙（n=7），中位日剂量为每位参与者29.4mg/天）。其余24名和13名患者分别接受了他克莫司（中位日剂量为每位参与者4mg/天）和霉酚酸酯（中位日剂量为每位患者1787mg/天）治疗。所有3级ALT升高均发生在输注后36周内（9例在26周内），并且在糖皮质激素治疗后均得到缓解。该研究中，没有患者出现符合Hy's法则的严重药物性肝损伤，并且几乎所有出现ALT升高的患者（96.2%）都在治疗后得到了缓解。

表2 经肝脏靶向的AAV基因治疗后，现有Ⅲ期临床试验中ALT升高的临床表现和管理概述

（图片来源：Mücke MM et al，J Hepatol，2024）

 

表3 GENEr8-1试验中用于控制ALT升高和免疫介导的宿主反应的其他免疫抑制剂概述

（图片来源：Mücke MM et al，J Hepatol，2024）

 

在HOPE-B试验中，出现ALT升高的患者数量显著低于GENEr8-1试验：有11名患者（20%）在基线后出现ALT升高，并报告为不良事件（AE），其中大多数为轻度（3名患者为0级，7名患者为1级）。仅有一名患者经历了3级ALT升高。从输注到首次ALT升高的时间较早（中位数为5.1周，所有ALT升高均发生在前17周内），而ALT升高的持续时间则相当（HOPE-B试验中位数为17天）。大多数ALT升高的患者接受了糖皮质激素治疗（n=9/11），治疗的中位持续时间为74天，期间未使用其他免疫抑制药物来控制和解决ALT升高。未报道有患者在26周后需要类固醇治疗，也未报告与类固醇相关的AEs。推荐的泼尼松剂量最初为每天60mg，持续7天，然后在第2周减少至每天40mg，第3周和第4周减少至每天30mg，之后维持剂量为每天20mg，直至转氨酶水平恢复到基线水平。然后，泼尼松的每日剂量每周减少5mg。所有ALT升高均得到解决。

综上所述，对接受AAV基因治疗的患者进行密切的ALT监测是合理的：当前指南建议在基因治疗的前6个月内每周监测一次，之后每年监测一次，持续2年。目前正在开展试验，评估在A型血友病患者中预防性使用免疫抑制疗法的效果，这些患者药物性肝炎的发生率较高（例如GENEr8-3，NCT04323098）。未来研究需要评估在接受与药物性肝炎发生率低或病情较轻的基因治疗的患者中，延长ALT监测间隔的可行性和安全性。对于已经检测到中度至重度ALT升高的患者，需要更密切地随访，并进行更全面的检查（例如血清胆红素、国际标准化比值、血清乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、C反应蛋白、血细胞计数等），以排除其他导致ALT升高的原因，包括溶血、机械性胆汁淤积或胆管炎/胆囊炎。如果临床情况合适，可能需要进行超声检查或其他影像学检查。

在治疗前，应筛查患者是否伴有肝脏疾病(如病毒性肝炎、酒精性或非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性或胆汁淤积性肝病)。血友病患者由于既往输血史或接受过血液制品而面临更高的病毒性肝炎风险，因此在开始AAV基因治疗之前应优先治疗病毒性肝炎。因为免疫抑制治疗可能是必要的，并使未经治疗的乙型肝炎或丙型肝炎恶化。如果给予糖皮质激素（>10mg，持续>4周），则HBsAg阴性、抗HBc阳性的患者面临HBV再激活的中度风险（1—10%）。因此，当前指南建议这些患者每1-3个月监测一次HBsAg和/或HBV DNA。值得注意的是，迄今为止，所有Ⅲ期临床试验均排除了晚期慢性肝病或肝硬化的患者，且对于晚期肝纤维化患者的风险-效益比尚无数据，因此需要采取个性化治疗方法。

在最近一项研究AAV8基因治疗Crigler-Najjar综合征的安全性和有效性的试验中，采用了预防性类固醇治疗，首先通过静脉注射给予100mg甲基强的松龙，随后口服40mg强的松，从第3周开始逐渐减少剂量，并在第8周停止。虽然这一患者群体的初步结果较为积极，但在与高风险相关肝炎或针对潜在肝脏疾病的基因治疗相关的背景下，预防性类固醇方案需要进一步评估。由于该方案在血友病患者中的治疗效果也正在进行临床试验，因此目前无法就AAV介导的血友病基因治疗中预防性类固醇的使用提出建议。

在排除其他原因导致的AAV基因治疗相关ALT升高的情况下，应启动免疫抑制治疗，目前最好的方案是口服泼尼松或泼尼松龙，起始剂量为60mg/天。如果治疗过程中转氨酶恢复正常，则应在至少8周内逐渐减少剂量。其他治疗选择包括布地奈德、甲基泼尼松龙（用于严重病例）、他克莫司或霉酚酸酯。值得注意的是，ALT升高可能不止一次发生，患者应在免疫抑制剂成功治疗后进行监测，并在再次升高时重新治疗。目前尚未确定需要免疫抑制升级的触发因素，并且对于何时应进一步采用免疫抑制治疗尚无共识。研究人员认为，大多数自身免疫性肝炎的数据来源于硫唑嘌呤的使用，通常起始剂量为0.5—2.0mg/kg，因此更倾向于使用这种药物，并考虑在泼尼松龙治疗至少2周后ALT升高未开始显著降低或类固醇减量期间复发的情况下引入此药物。另一种选择是霉酚酸酯莫菲，剂量高达2000mg/天。在基因治疗研究中，它更常被用作替代免疫抑制剂，而在自身免疫性肝炎治疗中，它被视为二线治疗的首选，最近的一项试验初步报告也表明其作为一线治疗也具有良好的疗效。如果肝炎进一步恶化，应再次排除其他诊断，并可以考虑将额外类固醇剂量增加至甲基泼尼松龙每天最多10mg/kg，持续最多3天，之后逐渐减量：这种剂量增加方案已在基因治疗研究中使用（某些泼尼松龙治疗失败的病例中）。

总结

血友病AAV基因治疗的获批具有极大的积极意义和潜在价值，能显著改善凝血障碍患者的生活质量。虽然该治疗可能会带来肝炎、ALT升高等副作用，降低治疗效果，但如果持续加强血液学家、肝病学家和患者群体之间的密切合作，就能进一步提升这一创新疗法的价值并最小化其风险。未来，研究人员还需继续关注血友病基因治疗中未明确的生物学机制，优化治疗方法，让基因治疗造福、惠及全球病患。