肝细胞癌（HCC）是全球卫生领域的一项重大问题。已有研究表明，传统的化疗、化疗-激素疗法和适形放疗对HCC均效果不佳。因此，迫切需要新的HCC治疗方法。识别与侵袭、转移、凋亡和生长调控相关的基因中的单个或多个突变，我们能够更全面地理解恶性转化、肿瘤进展和宿主相互作用的分子遗传学基础。这些理论知识的积累推动了HCC新型治疗方式——基因治疗药物的发展。

近日，来自伊朗卡尚医科大学的Leila Kalantari研究团队在期刊《Virology Journal》上发表的题为“Recent advances in various adeno-associated viruses (AAVs) as gene therapy agents in hepatocellular carcinoma”的综述，深入研究了AAV载体的功能，并全面概述这一载体系统在快速发展的癌症研究领域中的最新进展和潜在应用。

本篇分为上下两期，上期已为您详细介绍AAV载体特点，HCC基因治疗中重要的几种AAV血清型以及AAV在HCC基因治疗研究中面临的挑战和优劣势。

本期将为您介绍：AAV基因疗法在肝细胞癌（HCC）中的详细研究进展以及未来发展方向。

 

上期内容回顾：上篇 | AAV在肝细胞癌基因治疗研究中的最新进展

 

1. AAV基因疗法在HCC中的研究进展

目前，AAV载体已通过改造用于治疗患有肝脏疾病的患者，如病毒性肝炎、家族性高胆固醇血症和肝癌（HCC）。值得注意的是，在一项早期试验中，研究人员构建了包含单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因的rAAV，该基因受人甲胎蛋白（AFP）增强子和白蛋白启动子调控。结果显示，该病毒对表达AFP的肝癌细胞产生了靶向细胞毒性作用，而对非肝细胞肿瘤细胞和不表达AFP和白蛋白的肝细胞肿瘤细胞则没有影响。

研究人员对HCC基因治疗所采用的方法进行了分类，包括：（1）重新激活肿瘤抑制基因或抑制癌基因；（2）直接引入携带毒素或凋亡因子（如TRAIL）的rAAV；（3）自杀基因治疗，也称为GDEPT（基因导向酶/前药疗法），启动肿瘤细胞的死亡；（4）利用AAV载体进行抗血管生成基因治疗，最终导致肿瘤细胞凋亡并防止转移；（5）通过AAV载体直接给予细胞因子和免疫调节基因，或通过携带细胞因子的rAAV载体修饰免疫细胞（即免疫治疗），吸引免疫细胞靶向肿瘤，从而引发抗肿瘤免疫反应。具体如图3所示。

 

图3 HCC基因治疗策略示意图

（图片来源：Hadi，M.，et al. Virol J，2024）

激活肿瘤抑制基因/阻断癌基因

由于AAV缺乏自主复制能力、安全性高、表达持久而被广泛用于基因治疗和癌症治疗中，包括过表达蛋白质、引入shRNA、RNAi策略以及抑制致癌miRNA疗法。AAV还促进了联合治疗的发展，为癌症治疗提供了新的可能。

AAV-3-miR：研究人员评估了AAV3-miR-26a/122载体在体外抑制HCC细胞增殖以及在小鼠模型中抑制人源肝脏肿瘤的效果。通过将不同感染复数（MOI）的AAV3-miR-26a、scAAV3-miR-122或两种载体共表达的高斯荧光素酶（GLuc）报告基因转导至人类HCC细胞系Huh7中。在最大分子量（MOI）为1×10⁵vgs/cell（病毒基因组/细胞）时，每种载体仅检测到中等程度的细胞生长抑制（12-13%），且这种抑制与剂量相关；当同时被两种载体转导时，观察到约26%的细胞生长抑制。另一方面，在小鼠异种移植模型中，AAV3-miR-26a和scAAV3-miR-122载体也能够抑制肝肿瘤的生长，抑制率约为70%。该研究说明了通过AAV3载体联合递送AAV3-miR-26a和scAAV3-miR-122以靶向人类肝脏肿瘤的潜在应用价值。

AAV-8-NPC2：NPC2通常在健康肝组织中呈高水平表达，但在人类HCC组织中呈下调趋势。在肝癌细胞系中敲除NPC2已被观察到可刺激细胞增殖、迁移和异种移植肿瘤的形成。相反，当NPC2过表达时，它会抑制由HuH7细胞促进的肿瘤生长。此外，已证实通过AAV8递送促肝药物可减少炎症浸润，降低两种早期HCC指标：生存素（survivin）和磷脂酰胺醇蛋白聚糖3（Glypican3，GPC3）的表达，从而抑制小鼠体内HCC的发展。

毒素和促凋亡因子的递送

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）能够在肿瘤细胞中触发凋亡（或程序性细胞死亡），同时保留大多数正常细胞。然而，当作为单一疗法使用时，许多原发性癌细胞对TRAIL治疗会表现出耐药性。研究人员发现，过表达的miR-221/222促进了细胞增殖并抑制了凋亡。因此，他们针对miR-221/222的miR-Zip抑制剂，并通过AAV介导基因治疗共表达TRAIL和miR-221-Zip，在体外加快了细胞死亡。在体内试验中，对表现出对TRAIL具有抗性的肝癌异种移植小鼠使用AAV-TRAIL-miR-221-Zip进行治疗，结果同样显示肿瘤的生长受到抑制。研究人员还探索了AAV-hTERT-TRAIL与顺铂联合治疗HCC的潜力。结果发现，用AAV-hTERT-TRAIL和顺铂处理的BEL7404肝癌细胞中TRAIL表达增加。与单独使用AAV-hTERT-TRAIL或顺铂相比，联合治疗表现出更高的细胞毒性和更显著的癌细胞凋亡现象。在动物试验中，这种联合疗法有效地抑制了肿瘤生长并导致肿瘤细胞死亡。此外，其他研究还表明，放疗可能增强rAAV在HCC细胞中的摄取。

AAV-9-shGαi2：研究人员发现Gαi2在人肝癌细胞和肝癌局部组织中均上调表达，且与不良预后相关，由此推测可作为治疗靶点和诊断标志物。他们通过沉默或敲除Gαi2，发现显著抑制了永生化HepG2细胞和患者来源的原发性HCC细胞的增殖和迁移能力。此外，它还诱导了细胞周期停滞和半胱天冬酶介导的凋亡激活。同时Gαi2的沉默或敲除在原发性HCC细胞和HepG2细胞中引起了活性氧（ROS）的产生和氧化损伤。

自杀基因疗法(基因导向酶/前药疗法)

自杀基因疗法通常采用三种主要系统：HSV-TK/GCV（单纯疱疹病毒胸苷激酶/戊环鸟苷系统）、CD/5FC（胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统）以及PNP/FP（嘌呤核苷磷酸化酶/磷酸氟达拉滨系统）。

研究人员构建出多种双顺反子rAAVs，以研究自杀基因与编码不同免疫刺激因子的基因联合转导对TC-1细胞（由HPV-16转化而来的C57BL/6小鼠细胞）的致癌性和免疫原性的影响。这些构建体中携带单纯疱疹1型胸苷激酶基因（HSV-TK）以及免疫刺激因子基因—单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、小鼠B7.1共刺激分子（B7.1）或小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），在感染细胞中共表达。同时，还使用了携带新霉素耐药基因（neo）和HSV-TK基因的rAAV，以及携带lacZ基因的rAAV作为对照。这些构建体在人体293T细胞和啮齿类TC-1细胞中均表现出功能性。为了在小鼠中进行试验，研究人员首先在体外TC-1细胞中以平均每个细胞50个rAAV病毒粒子的倍数进行转导。随后，将这些细胞注射给5周龄小鼠。实验组小鼠中，一半从第5天开始每天给予2.5mg的更昔洛韦（GCV），并持续10天。除了接种表达HSV-TK+B7.1或HSV-TK+MCP-1的rAAV的小鼠外，无论是否给予GCV，其他小鼠均未出现肿瘤。接种了表达HSV-TK+GM-CSF的rAAV转导的TC-1细胞的小鼠，表现出肿瘤抑制作用减弱，但在这些小鼠中，未接受GCV治疗的小鼠的肿瘤抑制效果略为明显。仅在接种了表达HSV-TK（未检测到免疫刺激因子）的rAAV的TC-1细胞的小鼠中，GCV治疗表现出明显的抗肿瘤效果。在第54天，无肿瘤小鼠接受了未经处理的TC-1细胞的刺激。观察到肿瘤耐药率除了与免疫刺激基因有关外，还与GCV治疗相关。预先转导了表达B7.1或MCP-1的rAAV的TC-1细胞的小鼠，在不给药GCV情况下，表现出最高的免疫保护水平。由于rAAV2具有嗜肝性，因此它是恶性肝脏肿瘤中自杀基因递送的理想载体。

外泌体包裹的病毒载体(vexosomes)是一种新的基因递送方法。然而，vexosomes在自杀基因治疗中的有效性尚未明确。研究人员利用差速超速离心方法，制备了含有可诱导型半胱天冬酶9（iCasp9）自杀基因的AAV6 vexosomes。与模拟处理的Huh7细胞相比，当用前药（AP20187）刺激时，含有AAV6-iCasp9的vexosomes显著降低了细胞存活率（57±8% vs 100±4.8%，p＜0.001）。当将AAV6-iCasp9的vexosomes和AP20187共同进行瘤内注射给小鼠异种移植模型时，与未治疗小鼠相比，肿瘤消退体积增加了2.3倍。通过组织学检查和凋亡试验进一步证实了这些结果。研究表明，AAV6 vexosomes能够在肝细胞癌的异种移植模型中作为治疗手段使用。

AAV介导肿瘤血管生成

血管紧张素-(1-7)（Ang-(1-7)）的抗血管生成和抗增殖特性已在多种癌细胞中得到证实。一项小鼠H22肝癌模型中，研究人员构建出AAV8衣壳突变体(Y703F)，该突变体能显著增强转基因表达，确保了Ang-(1-7)在小鼠体内持久高效的表达，并使HCC的生长显著减少。而血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PGF)的去除进一步证实了这一结果。

AAV递送细胞因子修饰免疫抑制微环境

干扰素-γ（IFN-γ）是一种多功能细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种作用。研究人员利用AAV2载体在Hep3B细胞系中引入IFN-γ表达。同时，通过另一种AAV2载体转导DCs以表达AFP。这导致了强烈的AFP特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。DCs中AFP的表达与AAV载体中IFN-γ相结合，导致Hep3B细胞中人类白细胞抗原A2（HLA-A2）的表达上升，提高了针对AFP的CTL反应。最近的研究显示，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术工程化CAR-T细胞可以提高T细胞癌症治疗的安全性和效率。CRISPR/Cas9介导的细胞因子调节降低了毒性并增强了CAR-T细胞功能。在CAR-T细胞的活化和扩增过程中，通过旨在控制细胞因子信号的遗传方法可能会提高抗肿瘤效果、延长T细胞存活时间和/或降低毒性。研究发现，利用AAV-CCL19在肿瘤组织内引入CCL19的表达，促进了记忆T细胞（如记忆CAR-T细胞）进入肿瘤核心，使得CAR-T细胞在肿瘤内部的浸润数量增加，从而抑制了肿瘤生长。研究人员还通过AAV反式激活CRISPR-Cpf1系统，以高效的方式构建出具有免疫检查点敲除和同源定向修复(KIKO CAR-T细胞)功能的稳定CAR-T细胞。AAV-Cpf1 KIKO系统的模块化特性有助于在单个T细胞内高效地生成两种不同的CAR双敲入。与使用Cas9方法相比，AAV-Cpf1系统提高了生成双敲入CAR-T细胞的效率。此外，CD22特异性的AAV-Cpf1 KIKO CAR-T细胞在细胞因子分泌和癌细胞杀伤能力上与Cas9 CAR-T细胞相似，这一创新设计为T细胞工程提供了新思路。

 

2. 新型基因编辑技术联合AAV治疗HCC

CRISPR/Cas系统在HCC基因治疗中的潜力

基因编辑工具的飞速发展极大地提升了解决各类遗传性疾病的潜力，包括转录激活样效应因子核酸酶技术（TALEN）、锌指核酸酶技术（ZFN）和CRISPR/Cas技术。CRISPR/Cas系统主要通过两种途径进行HCC治疗：（1）直接编辑目标基因；（2）靶向间接位点以对抗HCC的进展。在直接靶向中，与HCC相关的基因，包括原癌基因和抑癌基因（TSGs）。研究人员利用CRISPR/Cas9技术破坏了HCC细胞中的转录因子ZIC2，从而显著抑制了肿瘤的生长。在间接策略中，CRISPR介导的基因操作与免疫治疗、抗肿瘤药物等方式相结合，以增强其疗效。例如，一项研究表明，使用CRISPR/Cas技术抑制胞外信号调节激酶2（ERK2），增强了HCC细胞对索拉非尼（一种广泛用于治疗HCC的多激酶抑制剂）的敏感性。明确CRISPR基因治疗递送的安全性和治疗有效性非常重要，其中腺相关病毒（AAV）载体具有高递送效率，因此目前是CRISPR基因治疗递送的主要选择之一。

CRISPR系统最常用的病毒载体—AAV

由于AAV独特的生命周期以及与宿主细胞的相互作用，它们已经发展成为具有商业可行性的基因治疗手段。AAV能够精确地修饰基因组，与所有现有的基因组编辑平台相比，AAV仅通过高保真性的同源重组（HR）途径进行工作，从而消除了在切割基因组DNA之前需要外源性核酸酶的需求。通过结合这些因素，研究人员获得了异常准确的编辑结果，这既保持了基因组的完整性，防止了在目标位点引入病毒序列或插入/缺失突变，又消除了脱靶遗传毒性的风险。研究发现，干细胞衍生的AAV（AAVHSCs）介导的同源重组具有靶向准确性高和递送效率高的优势。在体内，AAVHSC编辑在组织和有丝分裂后的细胞中均有效。此外，AAV还具有内在的递送机制优势。因此，这种独特的基因组编辑平台在纠正与疾病相关的突变方面显示出巨大潜力。

研究人员探索了最初用于病毒检测的Cas13a，将其作为一种在癌症治疗中进行基因干扰的工具。他们设计了一种Cas13a表达载体（DCUg），该载体使用不同的启动子来调控Cas13a和引导RNA（gRNA）的表达。在人HepG2细胞试验中，DCUg有效地沉默了报告基因和致癌基因（TERT、EZH2、RelA），诱导了细胞凋亡并抑制细胞生长，同时保留了正常肝细胞（HL7702）的活性。他们还将这一工具包装到AAV中，证明了其在体外抑制癌细胞生长和抑制小鼠肿瘤发展的有效性。此外，CRISPR/Cas系统还有可能成为抵御致癌病毒的有力工具。

3. AAV载体的未来发展

细胞外囊泡（EVs）包裹AAV可以规避基因治疗中产生NAbs的问题。一项研究中记录了利用外泌体包裹AAV（exo-AAV）载体作为肝脏递送系统的应用。该方法减少了载体递送剂量，同时保护了衣壳免受预先存在的体液免疫的影响。研究人员在体内评估了表达人凝血因子Ⅸ（hF.Ⅸ）的AAV8或AAV5以及exo-AAV8或exo-AAV5载体在靶向肝脏方面的有效性。结果发现exo-AAV8/exo-AAV5载体的转导效率显著提升，给予exo-AAV8载体的B型血友病小鼠hF.IX表达量显著增加，凝血时间显著改善。随后，评估了exo-AAV8对避开预先存在的AAV NAbs方面的有效性。exo-AAV8载体递送所促进的有效转导可能会增加适合肝基因递送治疗的受试者比例，即使在中等NAb滴度的情况下也是如此。因此，exo-AAV载体为提高肝靶向基因递送的有效性和安全性奠定了基础。虽然这种递送方法提供了多种益处，但尚未被应用于递送CRISPR/Cas系统。AAV基因治疗在人类疾病应用中通常表现出良好的安全性。但是，为了确保其长期安全性和有效性，持续进一步评估AAV载体安全性概况非常有必要。

总结

随着全球范围内HCC的发病率和死亡率以惊人的速度增长，迫切需要为HCC患者开发创新且可替代的治疗方法。在肿瘤学领域，腺相关病毒（AAV）载体具有能够转导至多种癌症原代细胞和细胞系的能力。此外，它们还能携带对癌症具有极高疗效的治疗性载荷。工程化AAV载体能够靶向原发性和继发性肿瘤，以及肿瘤起始细胞(或称为“癌症干细胞”)，这些细胞对常规治疗具有耐药性，并且是许多癌症治疗后预后不良和复发的重要原因，这将是非常有益的。总之，探索AAV载体在HCC基因治疗中的应用凸显了其在这一关键医学领域的潜力和挑战。AAV载体具有显著优势，包括其非免疫原性、高效进入细胞的能力、基因表达持久性和组织靶向能力。这些病毒载体在临床前研究和临床试验中已显示出安全性，但关于肿瘤发生的风险和预先存在的免疫反应对治疗效果的影响仍存在。因此，为了成功治疗肝癌，有必要开发针对HCC具有更高效率的AAV或腺病毒（Ad）载体。

当前治疗HCC的方法主要集中在提高重组病毒载体的治疗效率、不同病毒类型的血清型替代、病毒衣壳的化学修饰以及多种病毒类型的血清型替代。AAV载体与尖端技术（特别是CRISPR/Cas系统）的结合，预示着精准基因编辑新时代的到来。相比之下，尽管AAV介导的基因治疗在多种疾病的临床试验中显示出前景，但针对HCC的临床试验的缺失表明该领域仍存在巨大的未开发潜力,未来有望实现系统性给药、组织特异性靶向和具有最小副作用的基因编辑技术。为实现这一能力，研究人员必须在进一步严格评估AAV载体的安全性和有效性的同时，还要不断优化整合递送和基因组编辑技术。鉴于rAAV在基因治疗中的广泛应用和巨大潜力，有必要进一步研究其可能诱导肝癌发生的潜在风险，对接受肝靶向的AAV基因治疗的患者个体应进行全面检查，以评估其过去和未来的肝脏疾病状况。

本质上来说，有效实现AAV介导的HCC基因治疗的研究过程充满了胜利与挑战，这反映出科学发现、转化应用和临床审慎之间错综复杂的相互作用。在这一领域不断追求卓越的努力，预示着开创性疗法的诞生，强调了基因治疗在肿瘤学和人类健康领域中的动态影响力和深远意义。