AAV基因治疗

近年来，基因治疗领域依托病毒与非病毒载体的协同发展取得突破性进展，其中腺相关病毒（AAV）凭借其安全性高、组织靶向性强及分子可塑性突出等优势，成为临床转化中的核心递送工具。通过工程化改造天然血清型或构建合成衣壳，研究人员可精准调控其转导特异性并降低脱靶风险。重组AAV（rAAV）目前已推动超过200项临床试验，并在遗传性视网膜疾病、血友病、神经肌肉疾病等领域实现多项FDA/EMA获批疗法（如Luxturna、Zolgensma）。然而，AAV的衣壳容量限制（≤4.8kb）严重制约了其在基因治疗的推广和应用。

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劲帆生物医药科技（武汉）有限公司简称“劲帆医药”，创立于2022年，提供一站式病毒载体、蛋白和疫苗CRO/CDMO服务，拥有全球领先的规模化AAV制备专利技术平台及病毒载体/cGMP级蛋白/疫苗生产车间，致力于推进基因治疗药物、蛋白药物、治疗性疫苗更有效，更安全，更经济，更可及，赋能客户，造福患者。

劲帆医药已于2023年建成符合cGMP要求的生产车间，其中一期面积达6400m²，同年10月正式投产，包括4个P2级别种子建库区、5条蛋白/病毒生产线和1条灌装生产线，蛋白/病毒生产线生产规模分别为200L和500L，年最大产能可达50批次,目前已完成多项IIT、IND项目交付。

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文献解读

2024年3月，来自俄罗斯Martsinovsky医学研究所的Alexander S. Malogolovkin专家团队在期刊《Clinical and Translational Medicine》上发表了题为“Optimization strategies and advances in the research and development of AAV-based gene therapy to deliver large transgenes”的综述，文章系统整合了当前突破技术瓶颈的核心策略，包括微型基因设计与蛋白质结构优化、多载体协同递送及替代病毒开发，全面解析AAV技术的多元化发展路径，并重点评估制药领域内AAV介导大片段基因治疗的临床转化进展。此外，文章前瞻性提出利用神经网络与计算建模预测高效紧凑型转基因，为克服物理载量限制提供智能化解决方案。

1.微型基因——最小功能性基因变体

AAV衣壳高效包装的基因组上限约为4.8kb，当前共识认为rAAV的最适转基因长度应控制在3.5kb以内。这一限制推动了在保留功能前提下设计新型短基因变体的研究。本研究基于靶蛋白结构（图1），阐述了设计目标蛋白的主要工具与关键步骤。微型基因设计的核心依赖于结构生物信息学方法与蛋白质/基因数据库。已解析的靶蛋白三维结构能显著加速蛋白质工程进程，结合分子动力学模拟的蛋白质重构则有助于筛选出数千种不适用变体，从而缩小实验验证范围。

 

图1 针对靶向大片段基因的AAV基因疗法生物工程方法示意图

（图片来源：Kolesnik VV et al, Clin Transl Med., 2024）

 

目前已成功设计并完成功能验证多种与AAV载体包装容量兼容的微型基因。例如，微型耳铁蛋白（mini-OTOF）经AAV8递送可部分恢复OTOF敲除小鼠听觉毛细胞生理功能；AAV9-PHP.B递送的微型原钙粘蛋白15（mini-PCDH15）在Myo15-Cre敲除小鼠中能挽救听力损失，具有治疗Usher综合征1F型遗传性耳聋的潜力；USH2A基因缩短变体（minigene-4）建议可被用于AAV介导的Usher综合征2型遗传性视力与听力丧失的治疗；针对CEP290基因突变（常引发常染色体隐性遗传儿童盲症LCA）设计的微型CEP290基因经AAV2/8递送后，可延缓Cep290rd16小鼠视网膜变性；此外，还有由“浓缩型”cTSC2基因编码的用于治疗结节性硬化症（TSC）的微型结节蛋白。其中典型案例是肌营养不良蛋白微型基因的设计，用于杜氏肌营养不良症（DMD）治疗，该策略亦应用于2023年上市的基因治疗药物Valoctocogene roxaparvovec（Roctavian，BioMarin制药公司）——通过AAV5递送B域缺失的FⅧ变体实现凝血功能重建用于A型血友病治疗。

2.AAV表达盒基因调控元件的修饰

AAV表达盒的四个核心元件：反向末端重复序列（ITR）、启动子、转基因和poly(A)，它们对基因转移与表达至关重要（图2）。若载体容量允许，其他辅助调控元件可显著增强或调控转基因表达。

 

图2 AAV表达盒元件及其修饰

（图片来源：Kolesnik VV et al, Clin Transl Med., 2024）

启动子作为AAV表达盒的核心元件，是驱动并调控所连接转基因转录的顺式作用元件。RNA聚合酶Ⅱ介导的转基因转录严格受启动子及细胞特异性转录因子调控。启动子长度（约100-1500个核苷酸）直接影响AAV载体容量。AAV表达盒常采用组成型强启动子，然而该类启动子易导致转基因过度表达，可能引发免疫反应并损害功能。因此，组织特异性启动子成为更安全的替代方案。肌肉特异性启动子，如肌酸激酶CK6/CK8/MHCK7、结蛋白、人α-肌球蛋白重链αMHC、肌球蛋白轻链MLC2v、心肌肌钙蛋白cTnT等用于治疗脊髓性肌萎缩（SMA）、杜氏肌营养不良（DMD）及庞贝病；肝脏特异性启动子LP1应用于Hemgenix疗法治疗B型血友病。新型微型启动子如84bp的MP-84与135bp的MP-135，源自人胰岛素与胰高血糖素启动子区，在人胰岛内分泌细胞、肝细胞、脑及肌肉组织中表现出与大型CAG启动子相当的活性。此类短启动子可释放AAV载体容量，便于容纳大片段转基因及附加调控元件。

ITR作为～125(+20)bp的回文结构，核心功能包括介导基因组复制/包装与维持长效表达，其T型发夹结构是Rep蛋白结合及基因组多聚化的关键结构基础。通过对ITR进行定向修饰可构建自互补AAV（scAAV）——突变型ITR使单链基因组经分子内退火形成双链DNA，能够显著提升转导效率与表达速度。需特别指出，scAAV因双链基因组结构使其包装容量降至2.5kb左右，是成为限制其广泛应用的主要技术瓶颈。

其他元件优化，如转录后调控原件（PRE）与poly(A)亦可提升AAV容量。常用poly(A)包括SV40病毒、人生长激素（hGH）及牛生长激素（bGH）。缩短poly(A)序列虽能压缩基因长度，但未必完全保留功能。据报道，通过优化土拨鼠肝炎病毒PRE与poly(A)元件，将CW3SL载体缩短399bp，在AAV转导的海马神经元中能够维持EGFP表达水平，且小鼠海马CA1区的GFP表达率达亲本CWB载体的86.2%。

3.外显子跳跃

外显子跳跃技术通过靶向性剔除致病突变相关外显子，利用反义寡核苷酸（ASO）或CRISPR-Cas9系统干预RNA剪接过程，生成功能性微型基因变体（图1）。该技术借助AAV载体实现高效递送，其中CRISPR系统通过双AAV策略，分别表达Cas9、gRNA及供体DNA，成功校正小鼠OTC缺乏症；或通过小型化改造，将金黄色葡萄球菌SaCas9（较SpCas9短1kb）与gRNA共包装至AAV8载体，在小鼠肝脏实现＞40% Pcsk9基因编辑，显著降低血清Pcsk9及总胆固醇水平。此外，表达修饰型U7snRNA（可转录ASO）的AAV载体是传统基因替代疗法的创新方案，其通过核糖核蛋白颗粒保护ASO免于降解；表达靶向DMD外显子的scAAV9.U7snRNA.ACCA已在Dup2小鼠模型中成功验证。体内研究结果同样表明，新生儿单次注射scAAV9.U7snRNA.ACCA后，可实现高效且持续性的外显子跳跃、肌营养不良蛋白的产生以及在6个月时几乎完全纠正疾病表型。同样，AAV9-U7snRNA介导的外显子跳跃在mdx52小鼠中的长期疗效也得到了证实，恢复了肌营养不良蛋白的表达。然而该技术存在功能恢复不完全、个体化ASO定制成本高昂、疗效个体差异显著以及ASO潜在神经毒性等局限，且CRISPR体内编辑的伦理框架亟待完善，使其在突变广泛分布的基因中仍需依赖完整基因替代疗法。

4.多重AAV载体递送

（1）反式剪接和重叠序列

双重或三重AAV载体递送通过将cDNA分割编码到不同AAV载体，突破了单个AAV载体的容量限制，该技术基于AAV基因组具有头尾串联特性，已在多种疾病模型中展开研究。其中，双重AAV载体组装大片段转基因的方法包括反式剪接（TS）和重叠序列（OV）设计。

在反式剪接策略里，剪接供体信号（SD）和剪接受体信号（SA）序列分别置于AAV cDNA末端（图1B），经共转染后，其ITR按头尾方向多聚化连接，位于cDNA末端的SD与SA经反式剪接形成完整mRNA及蛋白质，该技术关键在于，SD序列需包含内含子5'端经典"AG"核苷酸模体，SA序列需含3'端"AG"二核苷酸，并通过生物信息学工具预测靶基因内潜在的剪接位点，经实验验证其剪接效率，基于该策略的UshTher疗法已进入视网膜色素变性临床试验阶段但结果尚未公布。

重叠序列设计则是通过在cDNA5'端与3'端设计同源重叠区（图1），使两个cDNA片段共享重叠区域，经同源重组连接产生完整基因产物。其最大长度受cDNA大小限制，需通过实验筛选最佳同源重组区域。尽管重叠序列设计能递送更大容量基因，但相比反式剪接载体，其在靶细胞内分割基因片段的成功重组与准确重新组装效率可能不高，导致全长基因表达不理想或存在差异。

（2）中介子

中介子介导的剪接是一种适用于递送无法完整包装于AAV载体的大片段基因的方法，其作为可转录翻译的遗传元件，广泛存在于细菌、真菌及低等植物中，长度通常为200-300个氨基酸，通过高度特异的蛋白剪接过程被移除，从而实现侧翼外显蛋白的位点特异性融合，形成功能性成熟蛋白，且该过程无需能量消耗等。分裂型中介子属反式剪接型，需N端与C端中介子协同作用。有研究报道，对比发现AAV中介子系统在重构ABCA4和CEP290蛋白方面效率高于双重AAV载体；且成功利用Npu dnaE分裂型中介子与AAV载体递送FⅧ-N6变体；混合策略结合同源重组与反式剪接，可拆分包装转基因至两个独立AAV载体中，已证实了其良好的转导效果；另有研究表明混合策略与反式剪接在体内递送大片段基因ABCA4与MYO7A至视网膜方面有一定优势。

然而反式剪接需精细设计剪接位点并优化序列，而多重AAV载体递送大片段基因在商业化应用中较为受限，且非反式剪接多肽产生的截短蛋白对细胞代谢的影响仍需进一步探究，仅携带部分转基因的AAV载体也可能启动基因表达。此外，中介子能够在蛋白水平发挥作用，但非哺乳动物来源的中介子可能携带隐性免疫原表位，与Cas系统联用可能加剧免疫反应，寻找高效分裂位点耗时且未必一定能成功，针对单一靶基因生产多重AAV载体会提高成本。对于重叠序列与混合策略，同源序列是决定分裂基因重构的核心要素，重叠序列具有基因特异性，混合策略中更优同源序列的发现有望提升重构效率。

5.用于微型基因设计的环状排列技术

环状排列（Circular Permutation, CP）技术作为一种借鉴天然机制的蛋白质工程策略，通过共价连接肽链首尾并在其他位点引入新末端实现结构重排（图3），其产物常保留原始蛋白的空间构象与功能，可用于提升催化活性、热稳定性及设计生物传感器、光遗传学工具等。CP可能有助于设计用于靶向基因治疗的新型微型基因。对与配体相互作用相关的传感域进行构象重排，可能创建一个大片段基因的功能性短排列变体拷贝（微型蛋白）。此外，可以创建环状排列的蛋白质文库，通过使用相关细胞模型的效价测试来检验其可行性。

 

图3 理性设计（A、B）和计算方法（C）用于蛋白质结构的微型化

（图片来源：Kolesnik VV et al, Clin Transl Med., 2024）

有研究展示了CP技术创建GFP分裂版本以重建蛋白质功能的可行性，这一方法同样适用于微型基因和微型蛋白的设计，有助于揭示蛋白质的关键结构元件。借助计算生物学和生物信息学的最新进展，CP蛋白质的分析与设计得到了显著推动。蛋白质理性设计借助计算方法实现了重大突破，许多研究团队利用软件设计出了具有靶标特异性结合能力的微型蛋白，尤其是针对蛋白质表面特定区域的纳米结合剂（类抗体结构）。目标蛋白及其结合伴侣的晶体结构对于高效计算对接微型蛋白至关重要，并且对设计超出AAV装载能力的大片段基因的最小功能拷贝具有深远影响。基于基因操作和体外筛选的理性设计或定向进化方法正在被机器学习技术所补充，后者能够探索蛋白质适应度景观，利用实验数据生成新变体并通过神经网络预测未知变体的功能。CP技术转化应用的另一个例子见于光遗传学工程，新型环状排列光-氧-电压传感结构域2（cpLOV2）具有独特的笼闭能力，并能够通过混合谱系激酶结构域样蛋白设计光诱导的坏死性凋亡。此外，cpLOV2被用于构建光控CAR T细胞（optoCAR T cells），方法是将光感受组件整合到工程化的分裂CD19中。在T细胞进行光控CAR转导后，观察到原代人CD4+T细胞的光诱导活化以及CD69标志物表达的增加。该研究表明，cpLOV2可用于各种临床和转化环境，以有效调节T细胞增殖、细胞因子产生并诱导肿瘤细胞杀伤。同样值得注意的是，AAV载体与光遗传学模块的递送兼容，其中一些已进入临床试验(NCT02556736，NCT03326336)。

值得注意的是，基于人工智能的计算工具可以设计出自然界中从未存在过的全新蛋白质。然而，其生物学意义以及稳定性和功能性仍然是一个艰巨的任务。

6.基因治疗研发格局

截至2023年11月，全球基于AAV载体的基因治疗研发管线包含321个在研产品，其中154个已进入Ⅰ至Ⅲ期临床试验，占比48%，但仅有8款产品（占总数2.5%）获得监管批准，突显该领域临床转化率低的显著挑战（图4、5）。此外，安全性问题也构成重大制约，如XLMTM疗法ASPIRO试验中高剂量AAV8载体（3.5×10¹⁴vg/kg）导致了四例致命肝毒性事件，揭示了对免疫机制认知不足以及剂量优化策略的迫切需求。为突破AAV衣壳容量限制，行业主要采用三大策略：开发可装入衣壳的功能性微型基因（如MicroDMD、miniATP7B，共占25个项目）、应用双或多重AAV载体分别递送大片段基因（如ABCA4、OTOF，其中2024年OTOF试验显示听力显著改善）以及利用基因编辑或RNA干扰技术（如亨廷顿病中AAV递送siRNA）。值得注意的是，大片段基因治疗靶点高度集中，DMD基因作为其中最长的人类基因之一，凭借数十年基础研究积累成为最热门靶标，在55个大片段基因药物中共占据10项；凝血因子FⅧ次之，有9个项目；遗传性视网膜病相关基因如ABCA4也是重点研究方向。尽管临床管线中有62%的项目聚焦首创药物开发，但其临床终止率较高（2022年18%暂停案例源于毒性），加之多载体生产工艺的复杂性及体内剂量标准化难题，共同凸显了技术创新与转化效率仍需突破的关键瓶颈。

 

图4 AAV的基因疗法的研究与开发前景

（图片来源：Kolesnik VV et al, Clin Transl Med., 2024）

 

图5 不同临床阶段的批准率和中间统计数据

（图片来源：Kolesnik VV et al, Clin Transl Med., 2024）

 

 

图6 AAV基因治疗的优势与局限

（图片来源：Kolesnik VV et al, Clin Transl Med., 2024）

未来前景

AAV载体基因治疗虽凭借其无致病性、可编程基因组、持久表达及规模化生产等优势成为首选递送工具，但其临床应用仍面临多重挑战：除衣壳容量限制外，疗效持久性受制于免疫与非免疫因素，剂量窗狭窄，以及既存中和抗体引发的安全与效率问题（图6）。未来突破方向包括：通过人工智能优化载体设计以降低免疫原性；开发低剂量长效表达方案；建立个体化治疗策略（如突变特异性基因编辑）；并完善抗体筛查与血浆置换等风险管控体系，最终实现精准、安全且持久的遗传病治疗。