导读

自20世纪60年代以来，基因治疗历经曲折发展，现已成为最受关注的生物医药领域之一。腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）属于细小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。重组腺相关病毒(rAAV)由于具有宿主范围广、免疫原性低、安全性高、可介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，是目前基因治疗领域最具应用前景的载体之一。数据显示，截至2023年，共有350项临床试验使用rAAV载体。截至2024年5月已有8款AAV基因治疗药物上市（见表1）。

大规模生产rAAV仍是基因治疗领域的主要瓶颈，目前工业界也在为提高rAAV产量和改善rAAV纯化方法付诸努力。rAAV的临床应用也凸显了对生产和纯化系统的迫切需求，这些系统必须能够生产大量和高质量的rAAV，以满足安全性、有效性、稳定性和成本要求。

表1 已上市AAV基因治疗产品

 

一、AAV的生产系统

rAAV的生产方法主要可以分为两大类：瞬时转染和病毒感染。在基于转染的rAAV生产系统中，三质粒共转染HEK293细胞是最广泛使用的生产系统。通过病毒感染生产rAAV涉及使用三种不同的病毒，包括AAV的天然辅助病毒（Ad和HSV）以及杆状病毒（baculovirus）。AAV的生产也涉及哺乳动物细胞（如HeLa、A549、HEK293）和昆虫细胞（如Spodoptera frugiperda，Sf9）。新开发的TESSA系统是另一种基于感染的系统，可在HEK293细胞中大规模高产rAAV。不同AAV生产系统及其主要优缺点汇总见图1。下文将对每种系统展开阐述。

 

图1 目前生产AAV的方法

（图片来源：Wang JH et al, Signal Transduct Target Ther, 2024）

（1）瞬时转染HEK293细胞生产系统

在HEK293细胞中以转染为基础生产rAAV时，包含目的基因（GoI质粒）、衣壳（cap）和复制（rep）基因（包装质粒）以及辅助病毒基因（辅助质粒）的三种质粒共转染到HEK293细胞中。该生产系统依赖于瞬时转染，在小规模和贴壁细胞培养中效果良好。目前的方法可以达到大约80%的细胞转染率，在转染后48-72小时达到病毒产量高峰。

瞬时转染方法具有灵活性，可以方便快捷地生成携带不同转基因的AAV以及不同血清型的AAV。此外，瞬时转染方法灵活多变，不需要耗时建立和维持特定载体产品的稳定生产细胞系。但该方法的可放大性是一个重要障碍。大量细胞的高效转染对贴壁系统和悬浮系统而言是一个瓶颈，其可变性不利于稳健的临床生产，尤其是在大规模情况下。另一个需要考虑的问题是高成本。通过质粒转染生产病毒的工艺需要耗费昂贵的GMP级别质粒与转染试剂。中信证券发布的《药品和创新产业链细胞基因治疗CDMO行业深度报告》中指出，质粒约占rAAV生产成本的20%。

 

图2 瞬时转染HEK293细胞生产系统

（图片来源：Hoeksema H et al, Bioprocess Insider, 2023）

（2）杆状病毒生产系统

在杆状病毒表达载体系统（Baculovirus expression vector systems，BEVS）最初是为大规模蛋白质生产而优化的，但在rAAV生产方面取得了重大进展。最初，在开发的利用杆状病毒感染昆虫细胞生产rAAV的系统中，将提供Rep、Cap和ITR核心表达元件分别通过Tn7重组整合到3种不同的杆状病毒基因组中，需要用这3种重组杆状病毒共感染昆虫细胞制备rAAV(Urabe M et al., 2002, Hum. Gene Ther. 13:1935-1943; US20030148506; US20040197895)。在此基础上进一步简化为2种杆状病毒的的生产系统，将Rep和Cap表达框整合到一种杆状病毒中(Smith RH et al., 2009, Mol. Ther. 17:1888-1896)。然而，两杆状病毒共同感染细胞效率较低，无法充分利用每个细胞的产能，而且感染是个随机的过程，容易产生不含核酸的空壳缺陷rAAV颗粒，制备工艺条件优化起来比较复杂，不同批次制备的rAAV质量不稳定。

因此，又在此基础上进一步开发了一杆状病毒系统(One Bac system)，主要有依赖细胞系的一杆状病毒系统、基于一个穿梭质粒的一杆状病毒系统和基于DH10Bac的一杆状病毒系统。依赖包装细胞系的一杆状病毒系统是先建立诱导表达AAV Rep基因和Cap基因的包装细胞系，再感染整合了携带外源目的基因(GOI)的ITR核心表达元件的重组杆状病毒BEV-(ITR-GOI)后，诱导细胞系中Rep和Cap基因表达进而产rAAV(Aslanidi G et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 206:5059-5064)。基于一个穿梭质粒的一杆状病毒系统则是将把AAV的Cap基因、Rep基因和ITR核心表达元件一起构建到一个穿梭质粒上，通过Tn7转座子介导的重组将穿梭质粒上携带的rAAV包装元件整合到一个杆状病毒基因组中，然后将这一种重组杆状病毒感染宿主细胞从而产生rAAV(Yang W et al., 2018, Mol Ther Methods ClinDev. 10:38-47.)。基于DH10Bac的一杆状病毒系统则是将AAV的Cap基因和Rep基因整合到DH10Bac中的杆状病毒基因组(Bacmid)中，通过Tn7转座子介导的重组得到包含ITR核心元件、Cap基因和Rep基因的重组Bacmid，将这一种重组杆状病毒(BEV)感染宿主细胞从而产生rAAV(吴阳等，CN201811618542)。由于杆状病毒的遗传不稳定性，外源基因插入在传统的Tn7转座位点在连续传代过程中容易丢失，导致rAAV的产量不断下降。目前，rAAV的生产稳定性得到了进一步优化，即将ITR核心元件、Cap基因和Rep基因插入杆状病毒基因组的相对稳定的插入位点，从而提高rAAV的生产稳定性。

重组腺相关病毒基因组中cap基因编码病毒VP衣壳蛋白，包括三种结构蛋白，分别为VP1、VP2和VP3，来自野生型病毒的AAV中VP1、VP2和VP3的化学计量比约为1:1:10，这样的化学计量比对于重组AAV的获得是很重要的。在哺乳动物细胞培养系统中，取得了三种AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的约为1:1:10的化学计量比，这依赖于哺乳动物细胞内含子两个剪接受体序列的交替使用以及对于VP2次优起始密码子ACG的使用。然而，由于哺乳动物细胞和昆虫细胞中内含子剪接机制的差异，在哺乳动物细胞中出现的表达策略不会在昆虫细胞中复制，从而导致野生型AAV在昆虫细胞中无法包装成合适的衣壳。

为了克服上述问题，Urabe等人开发出的昆虫细胞生产体系中，将VP1的起始密码子AUG替换为次优起始密码子ACG，构建一个单一的多顺反子mRNA，该多顺反子mRNA不需要剪接即可表达所有三种AAV2的VP蛋白(Urabe M et al., 2002, Hum. Gene Ther. 13:1935-1943)。然而AAV的血清型众多且与日俱增，Urabe等人的改造方法并不适用于所有血清型，例如Urabe等人使用ACG作为VP1衣壳蛋白起始密码子的杆状病毒系统中产生的AAV5颗粒具有不佳的感染性。在中国专利CN101522903A提供的方法中通过将包含有polh启动子序列的人工内含子插入到VP1的开放阅读框中，利用两个启动子分别表达VP1和VP2/VP3，该设计也能实现VP1/VP2/VP3在同一阅读框中表达，并能提高VP1的相对含量。针对Cap和Rep蛋白的表达，在中国专利202111105263.5使用了内含子选择性剪接调控策略，即利用内含子的剪接作用，对转录后的mRNA进行选择性剪接，获得合适比例的两种或多种mRNA，分别翻译成VP1、VP2/VP3、Rep78和Rep52蛋白，该方法能更有效控制VP1、VP2和VP3蛋白的化学计量比例以及Rep78/Rep52的相对表达。

 

图3 杆状病毒生产系统

（图片来源：Hoeksema H et al, Bioprocess Insider, 2023）

劲帆医药自主研发的One-Bac 4.0系统引入双内含子可变剪切的概念，将包装元件插入到必需基因座位，实现杆状病毒传代稳定性。同时优化cap和rep表达盒，增强感染活性。该系统制备的AAV产率高（病毒样品初产率可达1E+15-5E+15vg/L）且批次间稳定，实心率高，感染活性高，有效解决了AAV大规模生产中的挑战，为大规模高效生产AAV载体引入了新方法。

（3）哺乳动物稳定细胞系/辅助病毒Ad生产系统

基于Ad感染的AAV生产有两种稳定细胞系：包装细胞系（HeLa/A549）和生产细胞系（HeLa）。包装细胞系稳定整合AAV rep/cap基因。利用包装细胞系生产AAV的一个主要挑战是，细胞需要首先被AAV的天然辅助病毒感染，以启动内源性rep/cap表达，然后再被Ad-AAV杂交病毒感染。相反，生产细胞系包含rep/cap、Ad辅助基因和AAV基因组，在这种情况下，野生型Ad感染可激活rep/cap基因的表达，从而促进AAV基因组的拯救、复制和包装。

哺乳动物稳定细胞系/辅助病毒Ad生产系统的优势包括易于产品表征、可扩展性以及通过提高可重复性获得更高的AAV产量。数据显示，与转染生产方法相比，其产率提高了5-10倍。该系统也存在几个缺点。首先，建立稳定的细胞系通常是一个复杂且耗时的过程。其次，确保这些细胞系的特性和稳定性具有挑战。此外，为了确保最终基因治疗产品的安全性，必须采用稳健的下游纯化工艺来消除致病性Ad污染物和致癌HeLa DNA。

 

图4 哺乳动物稳定细胞系生产系统

（图片来源：Hoeksema H et al, Bioprocess Insider, 2023）

（4）rHSV生产系统

rHSV生产系统通常使用两种不同的rHSV，分别携带rep/cap基因和AAV基因组，依次感染HEK293或BHK细胞，然后进行下游纯化。该系统的优势在于载体生产的动力学以及所需的MOI远低于Ad感染所需MOI，原则上可一定程度加快生产速度并降低生产成本。该系统存在的缺点是需要产生足够数量的rHSV颗粒，同时需要建立有效去除终产品中神经营养性和神经毒性rHSV及其他相关污染物所需的专门纯化步骤。

 

 

图5 rHSV生产系统

（图片来源：Hoeksema H et al, Bioprocess Insider, 2023）

（5）TESSA系统

TESSA系统引入了一种工程Ad，通过在其主要晚期启动子（major late promoter，MLP）中引入一个可诱导的四环素遏制因子结合位点，抑制MLP。当有四环素类似物（强力霉素）存在时，这种经修饰的Ad功能正常。但在没有四环素类似物的情况下，Ad只进行基因组的复制，不生产新的结构蛋白。利用两种工程化Ad（一种编码rep/cap基因，另一种编码AAV基因组）共感染HEK293细胞生产AAV颗粒。通过对Ad生命周期进行调控，在保留Ad辅助功能的同时降低Ad污染。

二、HEK293和Bac/Sf9系统的比较

已上市的AAV基因治疗药物主要是三质粒共转染HEK293细胞生产系统和昆虫细胞杆状病毒生产系统（Bac/Sf9）,本文将重点阐述HEK293和Bac/Sf9系统的比较。已有一系列的研究旨在比较HEK293和Bac/Sf9系统的AAV包装。但缺乏对纯度、基因组完整性、感染性、翻译后修饰（post-translational modification，PTM）、体外和体内转基因表达以及体内疗效的系统性比较。近日，Avirmax公司在Molecular Therapy上发表的题为Systematic Comparison of rAAV Vectors Manufactured Using Large-scale Suspension Cultures of Sf9 and HEK293 Cells的研究论文，通过多种手段对HEK293和Bac/Sf9系统生产的高质量AAV进行了比较。

首先，ddPCR结果显示Bac/Sf9系统产量远高于HEK293系统。在2L生产规模下，Bac/Sf9系统的产量高54.18%，而在50L规模下的产量比HEK293系统高22.92倍。SDS-PAGE结果显示Bac/Sf9系统生产的AAVVP1:2:3指标更接近于1:1:10。DLS和HPLC结果显示Bac/Sf9系统生产的AAV聚集程度要低于HEK293系统。电镜观察两种系统生产的AAV空满衣壳情况，结果显示，Bac/Sf9系统生产的AAV空壳率低于10%，而HEK293系统生产的AAV空壳率约为30%。

 

图6 AAV的纯度、基因组完整性和空满衣壳比

（A）考马斯亮蓝染色结果；（B）银染结果；（C）琼脂糖凝胶图像；（D）HPLC检测聚集程度；（E）电镜观察完整和空衣壳；图片来源：Liu S et al., Mol Ther, 2023

其次，LC-MS/MS检测到两种系统生产的AAV的PTM存在差异，Bac/Sf9系统生产的AAV有更多的磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化和糖基化。

 

图7 LC-MS/MS检测PTM情况

（图片来源：Liu S et al., Mol Ther, 2023）

接着，TCID₅₀结果显示Bac/Sf9系统生产的AAV TCID₅₀/vg数值高于HEK293系统，这意味着Bac/Sf9系统生产的AAV具有更高的感染活性。ELISA检测体外转基因表达情况，结果显示，在体外培养的HEK293和ARPE19两种细胞系中，Bac/Sf9系统生产的AAV的转基因表达均高于HEK293系统。最后，在激光诱导脉络膜新生血管小鼠模型中，比较了两种系统生产的AAV的疗效情况。荧光造影及其定量结果可以看出，两种系统生产的AAV可达到相似的疗效。

 

图8 体外和体内转基因表达以及体内疗效结果

（图片来源：Liu S et al., Mol Ther, 2023）

总的来说，这项研究发现两种系统生产的AAV在许多关键质量参数上存在区别，但在体内疗效上无显著差异。Bac/Sf9系统生产的AAV在产率、聚集程度、空满衣壳比、感染活性等方面具有优势。

三、小结

在过去的25年左右的时间里，每一种AAV生产系统都得到了优化和发展，无论选择哪种生产系统都需要平衡灵活性、可扩展性和质量这三个标准，这对于开发安全有效的AAV产品以满足临床应用需求、安全性和有效性要求都至关重要。目前，没有哪一种生产系统是完美的（不同系统之间的比较汇总见表2），在选择生产平台时，需考虑是否能生产足够数量的治疗载体，以满足临床和商业需求。Bac/Sf9系统在分子和工艺水平上得到适当设计和优化，具有巨大潜力。

表2 不同AAV生产系统的比较

(表格来源：Merten OW, Microorganisms, 2024)

 

 

参考资料

1 https://www.biospace.com/

2 Wang JH, Gessler DJ, Zhan W, et al. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 2024 Apr 3;9(1):78. doi: 10.1038/s41392-024-01780-w.

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5 Aslanidi G, Lamb K, Zolotukhin S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Mar 31;106(13):5059-64. doi: 10.1073/pnas.0810614106.

6 Wu Y, Jiang L, Geng H, Yang T, Han Z, He X, Lin K, Xu F. A Recombinant Baculovirus Efficiently Generates Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Cultured Insect Cells and Larvae. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Jul 4;10:38-47. doi: 10.1016/j.omtm.2018.05.005

7 https://www.bioprocessintl.com/expression-platforms/large-scale-aav-production-advantages-of-an-insect-cell-baculovirus-expression-vector-platform

8 Liu S, Li J, Peraramelli S, et al. Systematic comparison of rAAV vectors manufactured using large-scale suspension cultures of Sf9 and HEK293 cells. Mol Ther. 2024 Jan 3;32(1):74-83. doi: 10.1016/j.ymthe.2023.11.022.

9 Merten OW. Development of Stable Packaging and Producer Cell Lines for the Production of AAV Vectors. Microorganisms. 2024 Feb 13;12(2):384. doi: 10.3390/microorganisms12020384.