近年来，A型血友病患者（PwHA）的治疗研究取得了显著的进展，但仍面临诸多临床挑战。其中，最主要的问题在于，约30%的A型血友病重症患者体内会产生针对FⅧ的抑制性抗体。FⅧ模拟双特异性单克隆抗体Emicizumab的出现，为这些患者提供了一种安全且有效的预防性治疗选择。目前，许多临床医生仍倾向于通过诱导对FⅧ的免疫耐受（ITI），以便在出现问题性出血时能够使用FⅧ进行有效治疗。证据表明，要实现ITI，需要通过重复性的FⅧ蛋白输注，使FⅧ得到长时间、不间断的暴露。随着基因治疗的发展，持续性表达FⅧ成为了可能。

2023年5月，来自美国纽约血友病基金会的Leonard A. Valentino研究团队，在期刊《Journal of thrombosis and haemostasis》上发表了题为“A review of the rationale for gene therapy for hemophilia A with inhibitors: one-shot tolerance and treatment?”的综述，文章深刻回顾了关于PwHA中FⅧ抑制物治疗过程中持续未满足的医疗需求、有效的免疫耐受诱导疗法（ITI）、FⅧ耐受的免疫学机制、最新的耐受策略研究，以及肝脏靶向性基因疗法在介导FⅧITI中的作用。

一、PwHA中抑制物的形成:持续未满足的医疗需求

1.抑制物和耐受性免疫学研究进展

FⅧ抑制物的产生由遗传和环境因素之间的相互作用所调节。研究表明，FⅧ的基因型是主要的遗传风险因素，同时其他免疫原性位点可能也起到作用。尽管有这些风险因素的信息，但在避免FⅧ抑制物产生方面，除了使用Emicizumab外，并没有明确的临床策略。对未经治疗的HIV感染患者的观察发现，FⅧ抑制物的减少或消失与CD4 T辅助细胞的下降有关，表明抑制物的产生和持续依赖于CD4 T辅助细胞。这种反应的B细胞可能始于边缘区B细胞的激活，并通过产生长寿命的记忆B细胞，从而最终产生短寿命和长寿命浆细胞。

FⅧ耐受可能涉及中枢和外周介导的耐受性机制，并需要主动产生调节性T细胞亚群来维持耐受环境。在临床实践中，人们认为原发性耐受的发展是通过早期在未经治疗过的患者中预防性暴露于FⅧ来实现的。这种策略导致调节性T细胞生成，从而抑制免疫原性反应。然而，在已存在FⅧ抑制物的情况下产生继发性FⅧ耐受则更具挑战性，需要抑制和/或消除FⅧ特异性T细胞和B细胞以及短寿命和长寿命浆细胞。

当前的ITI（优缺点见表1）依赖于反复静脉输注FⅧ，成功率大约为70~80%。在合理的时间间隔内，重复FⅧ输注无法产生一致的耐受性，从而衍生出新治疗策略试验，包括短暂性B细胞耗竭疗法和通过雷帕霉素抑制mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）途径。最近的两项研究表明，抑制物的动力学和免疫球蛋白G（IgG）检测可能可以预测ITI响应。例如，一项为期20年的意大利ITI注册研究确定了抑制物的峰值滴度≤200 BU/mL， ITI开始时滴度≤5 BU/mL， ITI期间滴度≤100 BU/mL可作为ITI成功的预测因子。另有研究表明，IgG4的增加和IgG1的减少同时发生是ITI成功的先兆表现。这些研究结果都有助于研究人员开发出更有效的治疗方案。

表1 免疫耐受诱导的临床和研究策略

（表格来源：Valentino LA et al, J Thromb Haemost, 2023）

 

 

2. A型血友病患者耐受性的研究进展

Emicizumab，这种非替代疗法彻底改变了治疗局面，无论抑制物状态如何，都能在止血时生成足够的凝血酶，同时减少皮下注射的治疗负担。然而，当PwHA患者出现突破性出血或需要手术时，持续存在的抑制物可能会影响Emicizumab的疗效。为此，ITI疗法仍被临床学者推荐，特别是对新诊断的伴有抑制物的PwHA患者。ITI具有不同的FⅧ给药方案和不同类型的FⅧ产品。此外，与疾病相关的因素，如ITI前的高抑制物滴度、ITI期间的峰值抑制物滴度或历史峰值抑制物滴度、年龄较大以及从抑制物诊断到开始ITI的时间跨度，都被认为是影响抑制物根除预后的因素。这些因素各自会在多大程度上影响基因治疗将是一个持续的研究课题。

腺相关病毒（AAV）介导的FⅧ基因疗法可能可以进行长期的内源性FⅧ表达，从而减少出血事件。如图1A所示，AAV载体的递送和转基因蛋白在肝脏中的表达启动了一系列复杂的免疫调节信号，减少了T效应细胞和B细胞的数量与功能，并增加了T调节细胞的数量。这些信号可能来源于多种细胞类型，包括肝窦内皮细胞、肝星状细胞和肝细胞。免疫调节反应由诱导耐受的分子介导，如转化生长因子β和白细胞介素-10，它们作用于多种细胞类型，包括各种抗原呈递细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）、CD4和CD8 T细胞以及B细胞。这些相互作用最终重置了免疫原性/耐受性的平衡，导致耐受结果，如图1B所示。这种重新平衡的免疫环境降低了FⅧ抑制性抗体的滴度，并使得转基因FⅧ持续表达，从而改善血友病患者症状，如图1C所示。但是值得注意的是，这种基因治疗策略目前仍然无法用于伴有FⅧ抑制物的PwHA患者，因为抑制物可能会中和转基因FⅧ蛋白。

 

图1 肝脏靶向性基因治疗作为获得免疫耐受的途径及其机制

（图片来源：Valentino LA et al, J Thromb Haemost, 2023）

 

截至目前，血友病基因治疗临床试验主要集中在无抑制物史的成年患者上，主要原因是基因治疗主要使用“非整合型”AAV载体，在儿童时期的肝细胞增殖会导致载体稀释效应，降低治疗效果。另外，大多数FⅧ抑制物在早期出现，通常在前20次FⅧ暴露中。抑制物持续到成年可能是由于之前尝试ITI失败或复发，或者长期存在抑制物。这些情况被认为是成功ITI的预后不良。还有证据表明，ITI的结果受到某些类型的F8突变的影响。表2总结了动物模型中的结果，这些结果构成了在伴有抑制物的PwHA背景下追求AAV ITI策略的基础，并列出了在动物研究中尚未回答的关键问题。

表2 腺相关病毒载体（AAV）免疫耐受诱导的现有数据摘要

（表格来源：Valentino LA et al, J Thromb Haemost, 2023）

 

最新的研究表明，基因治疗可能能够克服FⅧ抑制物的限制，并降低抑制物产生的风险。然而，基因治疗后的FⅧ表达水平是不确定的，且其持续时间也未知。尽管如此，基因治疗的一个潜在优势是能够实现稳定的内源性FⅧ表达，这不同于传统ITI治疗中的波动表达。但即使有了稳定的表达，也需要进一步的研究来确定这种治疗是否能有效实现免疫耐受，并确定免疫耐受所需的时间以及是否能在循环中维持功能性FⅧ水平。

二、 肝脏靶向性基因治疗的免疫学

过去二十年来，大量动物模型研究表明，使用AAV载体进行肝脏靶向性基因治疗可以诱导对肝细胞中表达的各种蛋白质的免疫耐受。将慢病毒基因转移到肝细胞或肝窦内皮细胞也有同样的效果，这充分说明肝脏微环境在促进对蛋白质抗原的耐受性诱导方面的能力。相关机制研究发现实现肝脏介导的耐受要求复杂，包括诱导FoxP3⁺调节性T细胞、效应T细胞的程序性死亡、在分泌蛋白情况下的中枢免疫耐受、肝脏内免疫抑制性细胞因子的表达、肝脏中表达的免疫检查点分子表达以及肝脏和肝淋巴结中的抗原呈递（如图1）。值得注意的是，即使在免疫原性抗原攻击后，也需要足够水平的转基因表达来诱导耐受性，以防止抗体和T细胞反应。这种方法已经成功地在小鼠和犬类血友病模型中得以验证。例如，在几只患A型血友病的犬类试验中，针对凝血因子FⅧ的抑制物的消除被证明需要数周至数月的时间，这取决于基线抑制物滴度。重要的是，消除这些中和抗体实现了有效的基因治疗。鉴于最近在PwHA患者中使用肝脏靶向的AAV基因疗法所取得的进展，说明该方法具有高度的转化潜力。此外，在动物研究中，当向肝脏递送的基因不足以诱导耐受性或逆转已建立的免疫反应时，采用雷帕霉素、B细胞耗竭或细胞因子阻断的联合疗法同样有效。针对ITI过程中仍有许多未解决的难题，包括基因转移引起的短暂肝毒性，克服抑制物所需的FⅧ表达水平，以及在临床试验中观察到肝脏FⅧ表达随时间的下降，转基因表达维持耐受性的持久性。

1.对基因疗法介导ITI的评估

过去对ITI疗效的定义包括抑制物的消除和输注FⅧ后药代动力学正常化（表3）。但由于Bethesda测定法无法检测非中和抗体，因此需谨慎使用Bethesda测定法和抗FⅧ免疫球蛋白水平来评估患者抑制物的消除情况。过去的研究和共识建议中，提出了输注FⅧ后恢复率至少应为预期值的66%，且FⅧ半衰期至少为6小时作为成功耐受的定义标准。FⅧ输注后，患者体内的抑制物滴度未出现因记忆性免疫反应而显著增加的情况，也被视为ITI成功的一个重要标志。

表3 过去研究中对成功耐受、部分缓解、失败和复发的定义

（表格来源：Valentino LA et al, J Thromb Haemost, 2023）

 

基因治疗作为ITI策略的一个独特方面是，在ITI后，伴有抑制物的PwHA患者中内源性FⅧ水平会增加，而无需完全依赖于因子预防。过去的基因治疗试验以49~52周时FⅧ活性的变化作为终点。在接受ITI基因治疗的个体中，FⅧ的检测时间尚不清楚，但是能检测到FⅧ的时间肯定比没有抑制物的要长。当抑制物是新发且滴度较低的情况下，通过基因治疗恢复FⅧ水平时间为2~3个月，但如果抑制物长期存在且滴度较高，基因治疗成功可能需要更长的时间。此外，对于伴有抑制物的PwHA患者，接受基因治疗后内源性FⅧ的产生反应与无抑制物的患者是否相似尚且未知。与无抑制物PwHA的基因治疗试验一样，伴有抑制物PwHA试验的次要终点也应包括FⅧ的年度使用量(或未达到耐受性时使用的旁路药物)和治疗出血事件。

2.建立耐受的辅助和替代策略

在A型血友病AAV基因治疗中，辅助免疫抑制使用较为常见，它可以减轻对转导肝细胞的免疫损伤，其主要方式通常是口服类固醇。尽管对于初次ITI尝试无效的患者，指南建议考虑使用免疫调节，并推荐抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗作为首选，但大多数情况下，免疫抑制并未纳入ITI方案中。免疫调节也可能产生不良后果。最近的研究表明，升高的B细胞活化因子水平可能会降低小鼠和患者对FⅧ的免疫耐受。在NHPs中使用肝脏导向的AAV基因治疗后，密集的T细胞定向免疫抑制也会导致免疫耐受。因此，免疫抑制的选择是开发成功的AAV基因治疗ITI方案的关键因素。

靶向造血干细胞（HSC）的FⅧ基因疗法已被确定为诱导耐受性的替代方法。这种方法包括两种策略：一是促进FⅧ在巨核细胞中的表达，使得FⅧ被封装在血小板颗粒中，从而避免被血液中的抑制物攻击，直到在血小板激活部位释放；二是基因递送后，非谱系特异性的FⅧ表达也诱导了免疫耐受性，并清除了预先存在的FⅧ特异性抗体。

3.基因治疗免疫耐受的最终临床作用

ITI仍然是唯一一种在A型血友病中能根除高应答FⅧ抑制物的方法。不论高剂量（200 IU/kg 每日）或是低剂量（50 IU/kg 每周三次）FⅧ治疗都被证明是有效的，其中高剂量方案通常能更快地实现耐受并减少出血事件。在设计方案时，仍需要仔细考虑几个变量，例如，研究人员应充分注意基因递送的时机（是否是关键因素未知）。另一个考虑因素是最佳的FⅧ表达水平，目前想要设定特定的FⅧ表达水平尚不可行，因为临床试验中已观察到FⅧ表达在个体间存在显著差异，且原因未知。最后，在动物模型中，药物免疫抑制可能会影响转基因特异性免疫耐受。因此，也必须仔细考虑常规预防性免疫抑制与按需免疫抑制的目标。

伴有抑制物的PwHA患者可能是基因治疗的潜在候选者，包括首次尝试ITI的患者，以及部分之前未能通过传统ITI治疗成功的患者，后者可能更多地包括具有不良预后特征的个体。然而，目前尚不清楚在这些高危个体中使用基因疗法成功诱导耐受性的可能性。同样，已发表的A型血友病基因治疗ITI研究的临床前研究中，仅使用了具有非常有限的F8突变系列的动物模型，包括小鼠中的无义突变和犬类中的22号内含子倒置样突变。因此，无法预测具有大片段的F8基因缺失的A型血友病患者通过基因治疗成功进行ITI的可能性。

三、来自患者视角

A型血友病患者（PwHA），包括那些伴有抑制物的患者，都希望能够拥有与未受影响的同龄人一样的生活方式。过去缺乏有效且安全的治疗方法，以及疾病和治疗带来的沉重负担，这些都是难以想象的困境。ITI可以帮助消除抑制物，但这是一个既费力又经常无效的改善抑制物策略。同样，能有效预防出血和减少治疗负担也是医疗保健人员和患者的共同目标。根据美国疾病控制和预防中心（CDC）的说法，“健康公平”是指每个人都有公平公正的机会达到最高水平的健康状态。为实现这一目标，CDC强调需要持续的社会努力来“解决历史和当代的不公，克服经济、社会和其他阻碍健康和医疗服务的障碍，并消除可预防的健康差异”。A型血友病患者的健康和健康结果不平等现象是显而易见的，表现为预期寿命缩短、生活质量下降，以及过多的残疾和死亡等。随着2017年Emicizumab药物的上市，可用于预防A型血友病的现有治疗方法得到显著改善。然而，由于治疗选择有限和疗效差异，患者的并发出血的急性管理仍然具有挑战性。此外，高昂费用也给患者和护理人员带来了不必要的负担，并可能加剧与经济稳定、粮食安全和包括住房在内的物理环境相关的慢性不平等现象。A型血友病患者进行基因治疗后成功表达FⅧ转基因，可能为ITI提供机会，从而减轻疾病和治疗负担。

四、总结

几十年来，研究人员在理解和控制FⅧ抑制物的产生方面进行了大量的临床和基础研究，但进展依旧缓慢。虽然FⅧ模拟疗法（如Emicizumab）现在为A型血友病患者提供了出色的预防性出血管理，但突破性出血仍然是个问题。几十年的“标准ITI”疗法表明，大约30%的伴有抑制物的A型血友病患者无法实现FⅧ耐受，甚至是经过长时间的ITI也无法实现。这些情况都表明，研究人员应该探索实现FⅧ免疫耐受的替代策略。针对肝脏的转基因FⅧ表达具有实现耐受的潜在益处。肝脏微环境是公认的、对内源性表达蛋白建立耐受的位点，而基因疗法提供的FⅧ的持续性表达也会增加诱导耐受的可能性。随着欧洲近期对无抑制物的A型血友病患者使用FⅧ基因疗法的监管批准，现在也可以为携带FⅧ抑制物的患者探索这种治疗方法提出强有力的理由。

原文链接：https://www.jthjournal.org/article/S1538-7836(23)00424-5/fulltext