乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是肝硬化(cirrhosis)和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的主要病因。目前，全球约有超20亿人感染过HBV，其中2.96亿人（约占总人口3.7%）患有慢性HBV感染，每年可导致全球约82万人死于肝硬化和HCC并发症。病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续存在是HBV抗病毒治疗的主要障碍，由于缺乏可行的动物模型来支持HBV cccDNA的形成，因此，HBV相关基础和转化研究受到很大的阻碍。

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劲帆医药基于One-Bac昆虫杆状病毒系统平台与武汉大学夏宇尘教授课题组共同开发了一系列新型AAV-HBV-1.04乙肝造模病毒产品，通过ATR介导DNA损伤（DDR）形成HBV cccDNA，使乙肝表面抗原HBsAg和HBV子代产生，实现更好地模拟病毒复制过程。产品成模率高、稳定性好、适用范围广，加速推进了乙肝病毒复制机制的研究及抗乙肝药物的研发进程。

乙肝（HBV）造模AAV    丁肝（HDV）造模AAV

此外，劲帆医药还拥有专业的体内外药效评价团队，可提供肝脏疾病药物筛选、药效学评价、药代动力学研究、Non-GLP非临床安全性评价等服务项目，全面覆盖药物临床前研究的完整流程。

 

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相关研究

2021年12月，武汉大学泰康医学院（基础医学院）医学病毒学研究所夏宇尘教授课题组在期刊《Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology》上发表题为“A Novel MouseModel Harboring Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA”的研究论文。该研究通过使用腺相关病毒载体（AAV）系统将复制缺陷的线性乙肝病毒基因组递送至小鼠肝脏，经过宿主ATR（Ataxia-Telangiectasiaand Rad3-related protein）介导的DNA损伤修复途径修复形成HBV cccDNA进而建立病毒持续复制的慢性乙肝模型。该模型可通过病毒表面抗原的表达指示HBV cccDNA的形成并用于抗病毒药物的临床前评估。

 

 

摘要图

（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）

1. 复制缺陷型pAAV-HBV 1.04载体制备

研究人员构建了HBV复制缺陷型载体AAV-HBV 1.04，该载体携带的HBV基因组从S基因区（核苷酸位点403-538）截断（图1A），并对AAV-HBV 1.04质粒转染的细胞、AAV-HBV 1.04病毒载体转导的细胞以及注射了AAV-HBV 1.04病毒载体的小鼠，评估了HBV复制标志物。

为验证pAAV-HBV 1.04载体复制缺陷型表型，研究人员将pAAV-HBV 1.2或pAAV-HBV 1.04质粒转染到Huh7细胞中（图1B）。实验结果表明，将pAAV-HBV1.2质粒转染到Huh7细胞中后，在细胞培养上清中检测到乙型肝炎e抗原（HBeAg）和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。而pAAV-HBV 1.04质粒转染后无法表达HBsAg（图1C），也未检测到代表新产生的病毒子代HBV-DNA（图1D）。结果证实pAAV-HBV 1.04载体本身无法支持HBV复制。

 

图1 pAAV-HBV1.04质粒的构建及验证

（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）

2. 体外AAV-HBV 1.04转导形成HBV cccDNA

为探究AAV-HBV 1.04病毒载体转导后是否能够形成cccDNA，研究人员对AAV-HBV 1.2和AAV-HBV 1.04载体进行滴定，并转导至HepG2细胞或AML12细胞中（图2A）。结果显示，AAV-HBV 1.2和AAV-HBV 1.04载体转导后均可导致HepG2细胞中HBeAg随时间显著增加（图2B）。与直接质粒转染不同，从AAV-HBV 1.04载体转导的细胞中可以检测到HBsAg，并且其表达量逐渐增加（图2B），在AML12细胞中也观察到类似结果（图2C）。为进一步验证HBsAg的产生，研究人员进行了免疫染色。如预期，AAV-HBV 1.2载体转导的HepG2细胞对HBsAg和HBV核心蛋白（HBc）均呈阳性（图2D）。与酶联免疫吸附测定（ELISA）结果一致，通过免疫染色可以在AAV-HBV 1.04载体转导的HepG2细胞中检测到HBsAg（图2D），Western blot进一步验证了HBsAg和HBc的表达（图2E）。在AAV-HBV 1.04载体转导的AML12细胞中也观察到了类似结果（图2F，G）。

由于pAAV-HBV 1.04载体缺乏完整的S基因区，这一结果表明在该模型中形成了另一种HBV转录模板，很可能是cccDNA。为验证这一假设，研究人员进行Southern blot分析，结果显示，在AAV-HBV转导的细胞中检测到了不同形式的HBV DNA。尽管由于HBV基因组插入片段大小不同，AAV-HBV 1.2和AAV-HBV 1.04的条带模式不同，但在两组中均可检测到cccDNA（图2H）。这些实验结果充分证明，AAV-HBV 1.04载体转导能够在细胞培养中支持HBV cccDNA的形成。

 

图2 AAV-HBV 1.04病毒载体转导细胞中HBV标志物的检测

（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）

3. HBV cccDNA形成机制

在HBV感染生命周期中，cccDNA主要通过松弛环状DNA（rcDNA，HBV-DNA在肝细胞内复制过程中的中间产物）转化形成，rcDNA通常来自输入病毒粒子的基因组和新形成的核衣壳的再循环。为研究该模型中cccDNA是否来源于rcDNA，研究人员使用抗病毒药物-核衣壳抑制剂（BAY41-4109和GLS4）和RNA逆转录抑制剂恩替卡韦（ETV）进行处理。结果显示，BAY41-4109和GLS4处理均导致HBc水平下降（图3A），BAY41-4109、GLS4或ETV处理均导致HBV DNA水平下降（图3B），而HBsAg水平保持不变（图3C）。由于在该模型中HBsAg只能由cccDNA产生，说明cccDNA的形成是通过其他机制。Southern blot进一步证实了这一结果（图3D）。

早期研究表明AAV感染会诱导宿主DNA损伤修复反应（DDR）。为了探究DDR酶是否参与cccDNA的形成，研究人员使用三种类型的DDR酶抑制剂：ATM抑制剂（KU-55933），ATR抑制剂（AZD6738, VE-821）和DNA-PK抑制剂（KU-57788）分别进行处理后发现，ATR抑制剂处理显著降低了HBsAg表达水平和cccDNA的形成（图3E），说明AAV-HBV 1.04病毒载体转导形成的HBV cccDNA是通过ATR介导的DNA损伤修复反应完成的。研究人员通过Southern blot进一步评估这些DDR酶抑制剂对该模型中cccDNA形成的影响，如图3E所示，与HBsAg ELISA结果一致，ATR抑制剂减少了HBV cccDNA的形成，而AAV-HBV伴随体不受影响（图3F）。

 

图3 AAV-HBV 1.04载体转导后HBV cccDNA的形成

（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）

 

4. HBV cccDNA的持续性表达

研究人员通过尾静脉注射AAV-HBV 1.04载体给小鼠，测试了该病毒载体是否可用于建立HBV cccDNA小鼠模型（图4A）。结果显示，注射后小鼠血清中HBeAg立即转为阳性，无论是在高剂量组（5×10¹¹vg）还是低剂量组（5×10¹⁰vg），均在8周后达到高峰（图4B）。低剂量组中，HBsAg表现出与HBeAg相似的动力学特征，而高剂量组的HBsAg在注射后4周达到高峰（图4C）。另外，注射后小鼠血清中也可以检测到HBV DNA（图4D）。研究人员通过免疫染色进一步确定了HBc和HBsAg的表达（图4E），在转导后1周，发现超过50%的肝细胞对HBc和HBsAg呈阳性。转导后44周，研究人员通过Western blot仍检测到HBc的表达（图4F），且HBc的表达只能靶向肝脏（图4G）。注射后1周未观察到明显的淋巴细胞浸润或肝脏损伤（图4H），说明该载体的安全性较高。

 

图4 AAV-HBV 1.04载体的体内转导

（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）

研究人员接下来评估了该小鼠模型中HBV cccDNA的形成。Southern blot揭示了包括HBV rcDNA、双链线性DNA（dslDNA）、AAV-HBV伴随体和HBV cccDNA在内的多种HBV DNA形式（图5A）。为区分该小鼠模型中不同的HBV DNA形式，研究人员利用酶消化策略：T5核酸外切酶可消化线性和部分双链形式的DNA；限制性内切酶SacⅡ可切割AAV载体骨架，从而使AAV-HBV伴随体线性化；T5核酸外切酶和SacⅡ联合使用可消化除cccDNA外的所有HBV DNA形式（图5B，C）。如图5D所示，从HepAD38细胞中利用Hirt技术提取的DNA显示出3条不同的条带，包括抗T5核酸外切酶处理的cccDNA。与AAV-HBV 1.2载体转导类似，经T5核酸外切酶和SacII处理后，在AAV-HBV 1.04载体转导样本中发现了一条与从HepAD38细胞中提取的cccDNA大小相同且不能被AAV特异性探针检测到的单一条带。此外，通过将样品加热至85℃（使rcDNA和dslDNA变性为单链DNA，而cccDNA不变性）进一步验证了cccDNA的存在。如图5E所示，来自HepAD38、AAV-HBV 1.2或AAV-HBV 1.04载体转导小鼠肝脏的cccDNA对85℃变性具有抗性。进一步用EcoRI处理可将cccDNA转换为dslDNA（图5E）。此外，对Hirt提取的AAV-HBV 1.04载体转导样本进行T5核酸外切酶和SacⅡ处理并进行测序，证实了完整的HBV cccDNA（图6A，B）。为进一步研究该模型中产生的HBV cccDNA是否能类似于天然HBV感染形成的cccDNA，研究人员评估了cccDNA与几种已知的cccDNA结合蛋白之间的关联性。染色质免疫沉淀（ChIP）分析显示，组蛋白H3、HBc和聚合酶Ⅱ与cccDNA均相关联（图6C），该模型中形成的cccDNA的染色质化和转录激活与通过感染形成的野生型cccDNA无差异。接下来，研究人员评估了cccDNA能否在小鼠肝脏中持续存在。根据肝脏DNA的Southern blot分析结果，在AAV载体转导后44周，可以以剂量依赖性方式检测到cccDNA（图6D）。即使在转导后66周，仍可检测到HBsAg、HBeAg（图7A）和HBc（图7B），这表明在该模型中HBV cccDNA的长期持续性，并通过Southern blot分析进一步确认了该结论（图7C）。

 

图5 AAV-HBV 1.04载体转导小鼠中HBV cccDNA特征

（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）

 

图6 HBV cccDNA测序和ChIP检测分析

（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）

 

图7 小鼠肝脏中cccDNA基因的长期表达和持续性

（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）

5. AAV-HBV 1.04小鼠模型适用于抗病毒评估

在AAV-HBV 1.04注射后一周，小鼠每天通过灌胃给予ETV，或通过静脉注射给予聚肌胞苷酸（Poly(I:C)），磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理的小鼠作为对照动物，2周后检测HBV复制标志物（图8A）。ETV是一种逆转录抑制剂，可以有效阻断HBV DNA的合成，但对cccDNA或病毒蛋白无明显影响。实验结果显示，ETV治疗显著抑制小鼠血清中的循环HBV DNA，然而对于HBsAg和HBeAg抑制作用则相对不明显（图8B）。在肝脏组织内部，ETV并未对HBV cccDNA产生显著影响（图8C）。此外，ETV治疗并未改变小蛋白HBs、HBc以及衣壳的表达水平，但却强烈抑制了衣壳HBV DNA（图8D）。当用Poly（I:C）处理小鼠时，所有经检测的HBV复制标志物均显著降低，包括血清中的HBsAg和HBeAg（图8E），以及肝脏中的小蛋白HBs、HBc、衣壳以及衣壳HBV DNA（图8F）。

 

图8 AAV-HBV 1.04载体转导小鼠的抗病毒应答

（图片来源：Xu Z, et al, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022）

总结

该研究开创性建立了一种新的含有cccDNA的AAV-HBV小鼠模型。这种小鼠模型利用ATR介导的DNA损伤修复反应促进HBV cccDNA的形成，同时肝细胞靶向的AAV载体递送具有低免疫原性、成模效率高、维持时间长等优势，为分析HBV cccDNA的调节机制，以及针对HBV cccDNA的新型治疗药物的临床前评估提供了一个理想的平台。

通讯作者介绍：

 

 

夏宇尘 教授

夏宇尘教授系武汉大学基础医学院教授、博士生导师、医学病毒学研究所所长，病毒学国家重点实验室PI，国家海外高层次人才项目入选者，湖北省医学青年拔尖人才（第一层次）。2005年于武汉大学生物技术专业本科毕业后，分别在中科院武汉病毒所和慕尼黑工业大学获得硕士和博士学位，其后在美国国立卫生研究院完成博士后研究。长期从事病毒性肝炎相关研究，在HBV实验模型的建立、病毒宿主相互作用机制和新型抗病毒治疗手段上做了一系列的工作。（1）在HBV模型构建方面：建立了人源干细胞分化肝细胞模型，可用于病毒宿主互作机制研究和药物筛选（Journal of Hepatology, 2017）。此外，建立了一种通过AAV载体介导的含有cccDNA的HBV小鼠模型,为深入研究HBV cccDNA和开发新型抗病毒药物提供了独特的平台（Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2022），阐明了小鼠不能感染HBV的分子机制（Hepatology, 2022）。（2）在病毒宿主互作机制方面：从分子水平揭示了HBV cccDNA可以被干扰素等细胞因子诱导的DNA碱基切除修复通路部分降解而不影响宿主细胞的机制，为清除HBV以及治疗慢性乙型肝炎提供了新思路（Science, 2014）。此外，干扰素诱导的分泌蛋白产物能通过与宿主细胞表面硫酸乙酰肝素竞争性结合而抑制病毒感染（J Immunol Res, 2017）。针对cccDNA调控，阐明了宿主因子SART1通过调控干扰素下游基因以及抑制肝细胞转录因子HNF4A两种途径来阻止HBV cccDNA转录的机制（Journal of Hepatology, 2021）。针对HBV致病机理，发现了HBV感染调控宿主细胞周期从而促进自身复制的机制（Journal of Virology, 2018）。（3）在新型治疗手段方面：揭示了HBV急性感染患者自我清除乙型肝炎病毒的机制,也在实验模型上证实了针对HBV包膜蛋白的CAR-T细胞的治疗潜力（Gastroenterology, 2016）。此外，开发了一种新型长效干扰素用于慢性乙肝的治疗，为临床治疗提供了新思路（Antiviral Research, 2019）。

主要研究成果在Science, Gastroenterology, Journal of Hepatology，Hepatology, Journal of Virology 等期刊发表，多篇入选ESI高被引论文。现为国际乙肝基金会新兴学者科学与医学顾问委员会（Hepatitis B Foundation’s emerging scholars Science and Medical Advisory Board (eSAMB)）委员，中华医学会医学病毒学分会委员，中国研究型医院学会病毒肿瘤学专业委员会常委，中国微生物学会病毒学专业委员会青年委员。担任Gastroenterology, Gut, Hepatology, Journal of Hepatology，eLIFE, Journal of Virology等杂志审稿人。