促卵泡激素（follicle-stimulating hormone, FSH）由垂体分泌，通过卵泡雌激素受体（FSHR）发挥作用,从而刺激雌激素产生、卵巢卵泡成熟以及精子生成。研究表明，FSH-FSHR信号传导异常会导致严重的疾病，特别是不孕症和卵巢过度刺激综合征（OHSS）。同样，越来越多的证据表明，性腺外FSHR的功能也与阿尔茨海默病、骨质疏松症、肥胖和癌症密切相关。然而，由于FSHR结构信息的缺乏、受体序列同源性高等原因，使得大部分现有小分子化合物的选择性较差，难以进入临床研究。因此，解析FSHR全长结构，并确定决定糖蛋白激素受体小分子特异性的关键氨基酸位点，对于指导靶向FSHR以及其他糖蛋白激素受体的小分子药物研发意义重大。

2023年1月，来自中国科学院上海药物研究所徐华强研究员联合浙江大学张岩教授、北京协和医院张抒扬教授，共同在《Nature Communications》期刊上发表了题为“Mechanism of hormone and allosteric agonist mediated activation of follicle stimulating hormone receptor”的研究性论文，首次通过冷冻电镜解析了全长FSHR分别与FSH和小分子激动剂Compound 21f（Cpd-21f）结合的激活状态结构以及小分子抑制剂结合的抑制态结构。

介绍

研究人员使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf9中共表达FSHR、mini-Gαs、Gβ1和Gγ2，成功制备了用于冷冻电镜实验的FSH-FSHR-Gs复合物样品，解析了FSHR在激活态和抑制态下的结构。同时，通过环磷酸腺苷（cAMP）反应测定细胞在受到刺激后产生的cAMP水平变化等功能实验，揭示了FSHR在激素激活和小分子结合中的分子基础，并确定了FSHR差异性识别不同小分子的关键氨基酸位点。这一研究成果为临床开发靶向FSHR及整个糖蛋白激素受体家族的小分子药物提供了重要的结构依据，以用于治疗相关疾病。

 

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在人体内，FSH与其他三种糖蛋白激素，包括促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)，绒毛膜促性腺激素（chorionic gonadotropin，CG），以及促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone, TSH），共同构成了糖蛋白激素亚家族并参与维持内分泌稳态。四种糖蛋白激素可作用于三种糖蛋白激素受体，除FSH作用于FSHR外，CG和LH可以共同作用于LHCGR，TSH则作用于TSHR。LHCGR和FSHR类似，主要在性腺高表达，共同参与调控人体性别发育、第二性征的维持以及生殖等。而TSHR则主要在甲状腺高表达，调控甲状腺的功能及人体代谢等。

1. 与FSH结合的FSHR-Gs复合物和非活性FSHR的结构

研究人员通过加入外源激素FSH和小分子激动剂Cpd-21f使FSHR处于稳定的激活状态，通过加入小分子抑制剂Cpd 24使FSHR处于稳定的失活状态，从而利用单颗粒冷冻电镜技术进行结构重塑（图1）。

 

图1 FSH-FSHR-Gs复合物和非活性FSHR的冷冻电镜结构

（图片来源：Duan J et al, Nat Commun, 2023）

2. FSH诱导FSHR激活机制

分析比较后，发现处于失活态和激活态受体的胞外结构域（ECD）构象变化最为显著，受体从失活态到激活态，其胞外结构域向上偏转了48°(图2a)。FSHR ECD的偏转伴随着跨膜结构域(TMD)的一系列构象变化（图2b—d）。在细胞外端，TM1、TM6和TM7有2—3Å的内移，而TM5在TM螺旋的中部有1—2Å的内移；相比之下，在TM6细胞内末端移动显著，多达14.9Å，这与A类GPCR激活的标志相符。另外，FSHR ECD结构的叠加显示，FSHβ的远端区域会与膜层发生碰撞（图2e），这表明在激活态受体结构中，FSH的碰撞推动FSHR ECD从膜层旋转至直立的ECD位置，这与CG、LHCGR结合以及TSH、TSHR结合相类似。另外，在铰链区域存在一个保守的磺酸化多肽（FSHR中的Y335，LHCGR中的Y331和TSHR中的Y385）参与激素结合和受体激活。FSHR中Y335G的单点突变导致FSH激活效能降低了10倍以上，而D334G/Y335G/D336G的三个联合点突变则导致FSH激活效能降低了100倍以上（图2f）。进一步表明，延伸的铰链区在将FSH-FSHR_ECD从膜层拉离并旋转至活性直立构象中起重要作用。

 

图2 FSH诱导FSHR激活机制

（图片来源：Duan J et al, Nat Commun, 2023）

3. 受体ECD-TMD信号传输的保守结构基础

与大多数A类G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）不同，糖蛋白激素的结合位点位于其受体ECD的远端。在激活态受体结构中，其ECD包含LRR（亮氨酸重复序列）1-12和铰链区，其中铰链区包括铰链螺旋、铰链环和LRR12，以及保守的P10区，P10区在FSHR激活中起重要作用。铰链螺旋被两个保守的二硫键夹在ECD和TMD之间，其中一个与LRR12相连，另一个与铰链C端的P10区（残基F353-Y362）相连（图3a）。在失活态受体结构中，铰链螺旋被拉长，并且与激活态受体结构中铰链螺旋方向不同（图3b），突出了铰链螺旋在FSHR激活过程中的重要作用。FSHR ECD通过两个主要界面与TMD相互作用，这也在LHCGR和TSHR中观察到（图3a,c,e）。第一个界面位于铰链螺旋和细胞外环1（ECL1）之间（图3a,c），点突变S273I位于铰链螺旋的N端，S273I突变可以增强从ECD到TMD的疏水相互作用，并提高FSHR的激活水平（图3c,d）。相比之下，在失活态受体结构中，铰链螺旋（相对于激活态FSHR结构）逆时针旋转约30°，因此与ECL1的相互作用很少（图3b），这证实了铰链螺旋与ECL1之间的相互作用对FSHR激活至关重要。第二个界面位于P10区和TMD上半部之间（图3e）。作为糖蛋白激素受体中最保守的区域之一，FSHR的P10区与TM1、TM2、TM7和三个ECL形成广泛的相互作用（图3f）。在这三种受体中，P10区的结构几乎相同，FSHR与LHCGR和TSHR之间的均方根偏差（RMSD，用于衡量蛋白质结构随时间的变化）分别仅为0.43Å和0.46Å（图3e）。对LHCGR和TSHR中P10残基的突变研究表明，大多数P10残基对受体激活至关重要。综上所述，这三种受体中相似的ECD-TMD构型为糖蛋白激素受体的ECD-TMD信号传导提供了保守的结构基础。

 

图3 FSHR激活信号从ECD传导至TMD的结构基础

（图片来源：Duan J et al, Nat Commun, 2023）

4. 变构激动剂激活FSHR的结构基础

根据电镜（EM）密度图显示，Cpd-21f结合位点位于FSHR的TMD口袋中（图4a），该口袋由TMD的上半部分构成，包括TM3、TM5、TM6、TM7、ECL2和ECL3，以及P10区的N端（图4b，c），结合位点主要由疏水残基组成（图4b，d）。数据表明，除F353A和M520A外，口袋残基的大多数点突变都会降低Cpd-21f对FSHR的激活能力（图4e）。与LHCGR和TSHR相比，Cpd-21f的位置几乎完全与这些受体-配体（LHCGR配体org43553，TSHR配体ML-109）位置重叠（图5a），这表明小分子别构激动剂激活糖蛋白激素受体的机制是保守的。

进一步，研究人员通过单点突变和多点突变，确定了这些受体中对小分子变构激动剂选择性起关键作用的残基。首先对ML-109进行了分析，发现TM6细胞外侧（构成变构激动剂结合口袋的一部分）的取向在FSHR和LHCGR之间几乎相同，但与TSHR不同（图5b）。与TSHR相比，FSHR和LHCGR的TM6的细胞外侧会向内移动，这导致它们与TSHR选择性配体ML-109发生碰撞。然而，将FSHR的TM6的胞外部分（残基591-599）与相应的TSHR的TM6区域（残基643-651）进行互换，并无法使突变的受体对ML-109产生反应（图5c）。同样，还采取了其他单点突变的方式，均无法提高FSHR对ML-109的反应。然而，当发生H615^7.42Y或I411^2.53M突变时，ML-109能够完全激活FSHR，当所有突变（H615^7.42Y/I411^2.53M/TM5/TM6/A352E）联合存在时，ML-109对FSHR的激活潜力和效力会进一步提升（图5d）。相应地，分子动力学（MD）模拟实验表明，野生型（WT）FSHR的结合自由能高于带有H615^7.42Y和I411^2.53M突变的FSHR。因此，H615^7.42Y和I411^2.53M突变有利于ML-109的结合，并增强了其对FSHR的激活能力。

Cpd-21f能激活三种受体，但对FSHR的激活效力最高。结构分析表明，Cpd-21f的N-乙基会与LHCGR中的Y612^7.42和TSHR中的Y667^7.42发生碰撞，从而降低了Cpd-21f对LHCGR和TSHR的激活效力（图5e）。同样地，FSHR中的H615^7.42Y突变导致Cpd-21f对FSHR的激活效力降低了近4倍（图5f），说明FSHR中的位点H615^7.42在确定FSHR配体选择性方面发挥了关键作用，并为设计针对这一重要受体的更特异性小分子激动剂提供了新的见解。

 

图4 变构激动剂Cpd-21f激活FSHR的结构基础

（图片来源：Duan J et al, Nat Commun, 2023）

 

图5 FSHR变构激动剂选择性的结构基础

（图片来源：Duan J et al, Nat Commun, 2023）

5. FSHR结构中与疾病相关突变的分布

糖蛋白激素受体具有许多与内分泌疾病相关的自然突变，这些突变分为失活态和激活态两种类型。FSHR中的突变数量相对较少，其中失活突变可能导致闭经、卵巢早衰和不孕，激活突变可能导致卵巢过度刺激综合征。FSHR的突变大多位于受体表面，而非跨膜区，这表明FSHR的跨膜区结构在糖蛋白激素受体中较为稳定。

基于激活态和失活态FSHR的结构，研究人员对FSHR的自然突变进行了建模分析。发现大多数失活突变，包括P348R、P519I、P587H，都位于关键的结构元件中，这些突变可能会破坏FSHR的稳定性，从而使其失活。P348位于LRR12的C端，P587位于受体的TM6束中，P519位于ECL2（图6a）。另一方面，激活突变，包括N431I、T449A/I^3.32、I545T^5.54和D567G^6.30，分布在FSHR的跨膜区（TMD）（图6b-e）。N431I突变位于ECL1，且靠近S273I突变，这可能会增强ECL1和铰链螺旋之间的疏水相互作用（图6b），从而提高FSHR的基础活性；T449A/I^3.32突变位于TMD的疏水核心，这可能会破坏T449^3.32和H615^7.42之间的相互作用（图6c）；I545T^5.54位于D581^6.44附近（图6d），D581^6.44是PIF基序的一个残基，在A类GPCR的激活中起重要作用。D567G^6.30突变也发生于LHCGR和TSHR中，它位于TM6 N端的最保守位置（图6e），可能会破坏D567^6.30和R467^3.50之间的离子“锁”，这是A类GPCR非活性状态中高度保守的结构元素。

 

图6 FSHR突变的结构性分析

（图片来源：Duan J et al, Nat Commun, 2023）

总结

研究人员通过对处于激活态和失活态FSHR的结构解析，并结合大量细胞水平的突变实验，系统地揭示了FSHR在激素激活和小分子结合过程中的分子机制。在此基础上，确定了FSHR在差异性识别不同小分子时的关键氨基酸位点。这一研究成果为临床靶向FSHR乃至整个糖蛋白激素受体家族开发用于治疗相关疾病的小分子药物提供了重要的结构依据。