促黄体素（luteinizing hormone，LH）和绒毛膜促性腺激素（chorionic gonadotropin，CG）是糖蛋白激素（glycoprotein hormones，GPH），调控着下丘脑-垂体-性腺轴的关键生理功能，如人体的性别发育和第二性征的发育与维持等。LH和CG是目前临床重要的治疗药物，它们通过促黄体生成素-绒毛膜促性腺激素受体（LHCGR）的胞外结构域结合来激活激活下游信号通路，调控下游激素的合成与分泌，如LH用于辅助生殖、CG用于诱导女性排卵等。尽管糖蛋白激素的临床应用已取得显著成效，但其如何激活人体细胞中受体的机制仍然未知。

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2021年9月，上海药物研究所研究员徐华强和蒋轶团队联合浙江大学研究员张岩团队在期刊《Nature》上发表了题为“Structures of full-length glycoprotein hormone receptor signalling complexes”的研究论文，系统报告了LHCGR处于失活状态和多种激活状态下的四种结构。该工作揭示了LHCGR与CG的相互作用的分子机制，同时提出了一种独特的受体激活“Push and Pull”模型，为临床开发内分泌疾病治疗药物的发现提供了理论基础和现实意义。

介绍

LHCGR蛋白由富含亮氨酸重复序列（LRRs）的胞外结构域（ECD）、铰链区和视紫红质七次跨膜螺旋结构域（TMD）三部分（图1a）组成。研究人员利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫Sf9细胞中共表达LHCGR、Gαs、Gβ1和Gγ2，获得LHCGR–G_s膜组分，然后与CG、纳米抗体Nb35共同孵育，组装成CG-LHCGR-G_s复合物。为了进一步提高CG-LHCGR-G_s复合物的稳定性，添加了小分子化合物Org43553。通过单颗粒冷冻电镜技术（cryo-EM），研究团队解析了3个近原子分辨率的全长LHCGR处于激活状态下的结构（图1b-d）：分别是Org43553-CG-LHCGR(S277I)-G_s复合物、CG-LHCGR(S277I)-G_s复合物以及CG-LHCGR(WT)-G_s复合物。

 

图1 CG-LHCGR-Gs复合物的冷冻电镜结构

（图片来源：Duan J et al., Nature, 2021）

LHCGR与CG相互作用机制

LHCGR的ECD结构域包含11个不规则的LRR，形成了一个弯曲的马蹄形结构，其中CG以手握手的方式与受体凹面内表面结合（图2a、b）。铰链区包含一个α螺旋、LRR10和LRR11，它们与LRR1-9共同构成完整的ECD。在铰链螺旋和LRR11之间是一个延长的铰链环（残基284-340），其中只有C端部分可见，该区域的一部分似乎与CG α-和β-亚基形成的界面相互作用。CG的表面包含几个离散的带正电荷的斑（PCP），它们与LHCGR ECD表面上的带负电荷的斑块（NCP）形成互补的静电相互作用（图2c）。CG与LHCGR的相互作用由CG两个亚基介导（图2d-g）。CG α-亚基的结合主要由Y88^α、Y89^α和S92^α介导，它们与LHCGR的LRR4-6中的Y127、I152、K180和Y182相互作用（图2d、f）。CG β-亚基的结合主要由其C端残基（92-106）介导（图2d、e），它们分别与LRR1中的R53、S55、A57和Y58（图2e）以及LRR7中的E206相互作用（图2d）。CG β-亚基的其他相互作用可见于残基V46^β和Q48^β，它们与LRR10中的Q246和R247相互作用（图2g）。

 

图2 CG和LHCGR的相互作用示意图

（图片来源：Duan J et al., Nature, 2021）

对CG-LHCGR和FSH-FSHR-ECD复合物的结构比较揭示了激素识别的特异性基础（图2h-j）。β-亚基之间的相互作用有很大不同。具体来说，β-亚基的C端“安全带”段采用了不同的构象，其中CG中P107^β的Cα原子与其在FSH中P101^β的对应原子相距6.4 Å（图2j）。在FSH中，与P101^β相邻的是L99^β和Y103^β，它们形成了一个疏水口袋，专门容纳FSHR的L55侧链。在LHCGR中相应的残基是体积更大的Y58（图2e），它会与FSH的L99^β发生冲突，表明这是特异性结构判别的一个关键位点。在LH β-亚基中对应的C端“安全带”段在CG中是保守的，因此允许LHCGR结合LH。另外的特异性位点位于CG β-亚基中的R94^β，它与LHCGR的E206形成“盐桥”（图2d）。对应的残基是FSH中的S89^β，FSHR中的D202。另一方面，FSH具有特异性的D90^β残基，它会与FSHR的K179形成“盐桥”。这两个对应的残基在CG和LHCGR中不存在，进一步说明了CG-LHCGR和FSH-FSHR这两个信号系统之间激素特异性的基础。

CG诱导受体激活的基础

为揭示激素诱导受体激活机制，研究人员探究了LHCGR的活性和非活性结构，成功解析出l3.8 Å的非活性野生型LHCGR的结构，该结构可以定位其ECD和TMD（图3a、b）。在非活性结构中，ECD向膜层倾斜，这与活性LHCGR复合物中的ECD几乎垂直于膜层（图3b、c）。CG的结合使ECD向上旋转约45°（图3c）。非活性LHCGR TMD与A类G蛋白偶联受体（GPCRs），包括视紫红质和β2肾上腺素受体（β2AR）的非活性构象相似，特别是在TM6的C端。与CG结合的LHCGR-G_s复合物相比，与激素结合后TM6的C端向外移动了12.3 Å，这是在D564残基的Cα原子上测量到的（上标指Ballesteros-Weinstein编号）（图3e）。伴随着TM6的向外移动，TM5向外移动了2 Å，而TM7向内移动了3.6 Å（图3e），这与A类GPCR激活的模式一致。

 

图3 激素诱导受体活化的基础

（图片来源：Duan J et al., Nature, 2021）

关键问题是CG与ECD末端结合是如何诱导LHCGR TMD激活。如上所示，CG与非活性LHCGR的结合会导致CG的远端区域与膜发生碰撞，从而推动CG-ECD复合物的向上旋转（图3d）。另一方面，研究人员在电子显微镜下观察到一处密度迹象，该迹象对应于与CG最右端相互作用的延伸铰链环的C端部分，但分辨率较差（图2a、b），这与FSH-FSHR-ECD复合物的相互作用方式相似。研究人员提出，铰链环与CG的这种相互作用有助于将CG-ECD复合物拉入向上位置。在铰链环中间是一个磺化的酪氨酸残基（Y331），被带负电荷的残基所包围，这些残基已被证明与CG表面的正电荷区域相互作用。将这些残基突变为不带电荷的残基（Y331A和D330G/Y331G/E332G突变体）会导致受体激活减少（图3f）。综上所述，这些结果为LHCGR通过CG激活的“Push and Pull”模型提供了证据。

在CG-LHCGR-G_s复合物中观察到两个主要的ECD-TMD界面（图4a-c）。第一个界面由ECD铰链螺旋介导，与细胞外环1（ECL1）紧密相连，ECL1也采用了两圈半的螺旋结构（图4a）。组成型活性的S277I突变位于铰链螺旋的N端，此突变增强了ECD-TMD结合界面。具体来说，S277I与来自ECL1螺旋的A430和I431形成了额外的疏水相互作用，从而稳定了ECD-TMD的相互作用。相应地，A430D、S277K和S277R突变可能会影响ECD-TMD界面并降低受体活性。在野生型受体结构中，ECD铰链螺旋采用了相似的构象，S277位于相同位置（图1e）。然而，S277无法形成与S277I相同的疏水相互作用；相反，S277处于与保守P10区域（残基350-359）的N351形成可能的“氢键”的位置，P10区域被认为是LHCGR和TSHR的拴系激动剂。第二个ECD-TMD界面由铰链C端的P10区域形成，它堆积在TMD束的中心顶部，并与TM1、TM2和TM7以及三个ECL相互作用（图4b、c）。在非活性结构中，该区域采用了与活性结构不同的构象（图4b），这表明受体激活涉及P10区域的构象重排。研究人员观察到P10区域与TMD的相互作用与之前的结构预测和突变研究相关性较高。该片段是糖蛋白激素受体中最保守的区域之一（图4b），这表明其激活机制高度保守。在活性结构中观察到的其他差异是在TM6和TM7的细胞外末端，它们从非活性结构转变为活性结构时会移动3-5 Å（图4d）。这些移动导致在M582和D578处形成螺旋扭曲，类似于β2AR中的拨动开关W286和PIF基序残基F282，这两个是A类GPCR激活的关键组件。M582和D578的残基类型在糖蛋白激素受体中保守，但与大多数GPCR不同，这表明糖蛋白激素受体已经从其他A类GPCR进化出独特的激活机制。

 

图4 LHCGR ECD与TMD的相互作用的示意图

（图片来源：Duan J et al., Nature, 2021）

CG-LHCGR-G_s复合物在ECD和TMD之间形成了一个完整的复合物结构。分子动力学模拟结果显示，当CG存在时，ECD到膜的距离及其倾斜角度均保持稳定；而在缺乏CG的情况下，ECD的取向则表现出明显的不稳定性。这一结果进一步支持了CG与ECD结合能够稳定ECD-TMD界面的观点。此外，CG-LHCGR-G_s复合物以单体形式存在，这与目前已解析的所有A类GPCR-G_s复合物结构一致。尽管FSH-FSHR-ECD复合物的晶体结构显示其倾向于形成二聚体或三聚体，但CG-LHCGR-G_s复合物在糖蛋白激素和G蛋白存在的情况下，由于其刚性结构，能够有效阻止受体的二聚体化或三聚体化。

Org43553作用的分子基础

Org43553是一种LHCGR变构激动剂，具有潜在的药物开发价值。电子显微镜图显示，Org43553插入到LHCGR跨膜结构域（TMD）上半部分形成的一个深口袋中（图5a），该结合口袋由TM3、TM5、TM6和TM7的残基，以及ECL2、ECL3和铰链C端的残基共同构成（图5c）。Org43553占据口袋的上部，其吗啉环暴露在ECD与TMD的界面上。分子动力学模拟进一步证实，Org43553的结合模式具有较高的稳定性。Org43553主要通过疏水相互作用与LHCGR结合（图5c，d）。为验证其功能，研究团队通过环腺苷酸（cAMP）反应实验发现，Org43553对LHCGR突变体A589W和I585F的激活能力显著下降（图5b）。这一实验结果与结构观察结果高度一致，表明Org43553的结合位点与CG结合ECD的位点不同，其作用方式类似于A类GPCR的正位激动剂。综上所述，Org43553是LHCGR的直接TMD激活剂，其作用机制与A类GPCR的正位激动剂相似。此外，Org43553能够在无CG的条件下激活LHCGR（图5b），这为其作为潜在药物的开发提供了重要依据。

 

图5 Org43553调控LHCGR的分子基础

（图片来源：Duan J et al., Nature, 2021）

总结

本研究首次解析了全长LHCGR处于失活状态和多种激活状态下的四种冷冻电镜结构，揭示了CG识别LHCGR的分子机制及小分子化合物Org43553与受体LHCGR相互作用模式，鉴定了糖蛋白激素选择性结合LHCGR和FSH受体的关键氨基酸残基，提出了激素配体激活受体的“Push and Pull”模型，为治疗内分泌疾病的药物设计提供了理论指导。