肝细胞癌（HCC）是全球卫生领域的一项重大问题。已有研究表明，传统的化疗、化疗-激素疗法和适形放疗对HCC均效果不佳。因此，迫切需要新的HCC治疗方法。识别与侵袭、转移、凋亡和生长调控相关的基因中的单个或多个突变，我们能够更全面地理解恶性转化、肿瘤进展和宿主相互作用的分子遗传学基础。这些理论知识的积累推动了HCC新型治疗方式——基因治疗药物的发展。

近日，来自伊朗卡尚医科大学的Leila Kalantari研究团队在期刊《Virology Journal》上发表的题为“Recent advances in various adeno-associated viruses (AAVs) as gene therapy agents in hepatocellular carcinoma”的综述，深入研究了AAV载体的功能，并全面概述这一载体系统在快速发展的癌症研究领域中的最新进展。

本篇分为上下两期，上期将为您详细介绍：AAV载体特点，HCC基因治疗中重要的几种AAV血清型以及AAV在HCC基因治疗研究中面临的挑战和优势。

1. AAV作为基因治疗载体的特点

AAV属细小病毒科家族成员之一，其基因组由Rep基因和Cap基因构成，Rep基因编码病毒复制所需的四种蛋白质：Rep40, Rep52, Rep68和Rep78。Cap基因通过不同起始密码子的选择性剪接和翻译编码三个衣壳亚单位：VP1, VP2和VP3。基因组两侧有两个末端反向重复序列（ITR），ITR参与AAV整合、复制、拯救和包装等过程，并具有转录启动子活性，因而对于AAV包装至关重要。本文将重点关注AAV2、AAV3、AAV6、AAV8和AAV9血清型，AAV基因组结构如图1所示。

 

图1 野生型AAV和重组AAV的基因组结构

（图片来源：Hadi，M.，et al. Virol J，2024）

AAV2

AAV2是基因治疗中研究最深入的血清型之一，最初于1965年发现。单独的AAV2的初级受体不足以使其高效进入细胞，还需要多种共受体以辅助进入，这些共受体包括整合素αVβ5和α5β1、层粘连蛋白受体(LamR)、肝细胞生长因子受体(HGFR)、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)和CD9。rAAV2衣壳经历多种翻译后修饰（PTMs），包括泛素化、sumo化、磷酸化和多位点糖基化。被选择的表达盒被封装在不同的针对不同组织的不同AAV衣壳中。目前普遍认为AAV2的包装转导能力和安全性都较高。AAV变异文库的构建和评估成为发现可用于基因治疗的新衣壳的有效技术，但需注意交叉包装（cross-packaging）和嵌合（mosaicism）现象。最近的研究表明，将AAV2载体交叉包装到不同血清型上可提高转导效率，如在AAV1、AAV3和AAV4衣壳中交叉包装AAV2显著提高了在骨骼肌中的表达水平。另一种增强特异性的方法包括选择一种启动子，该启动子本质上能刺激靶组织内指定基因的表达。

AAV2靶组织广泛，包括平滑肌、骨骼肌、中枢神经系统、肝脏和肾脏，且对肝细胞具有显著亲和力，但尚未转化为在体内有效靶向肝脏的基因治疗载体。研究人员证实了AAV2是从原代人肝脏样本中提取的天然嗜肝性AAV衣壳序列,衣壳突变可能是在组织培养繁殖过程中无意中获得的,这些突变带来的氨基酸修饰增强了对硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)的亲和力，HSPG是促进AAV2感染人肝细胞的主要细胞受体。为了促进AAV2的附着，衣壳残基R484、R487、K532、R585和R588与带负电荷的硫酸肝素多糖链相互作用。

AAV3

AAV3载体利用HSPG、FGFR1、LamR和hHGFR作为其受体。糖基化、磷酸化和乙酰化是rAAV3衣壳上的PTMs。最初，由于AAV3在小鼠细胞系和体外试验中转导能力有限而被基因治疗研究忽视。然而，随后的研究表明，利用hHGFR作为共受体能够显著增强AAV3对人肝癌细胞、非人灵长类动物（NHP）和人肝细胞的转导能力。在体外对原代人肝细胞和在体内对“人源化”小鼠进行转导的最有效方法是使用AAV3载体。这表明表达人类凝血因子Ⅸ（hFⅨ）的AAV3载体可能作为B型血友病临床基因治疗的更有效替代方案。事实上，AAV3在转导原代人肝细胞方面表现出了卓越的效率，在这方面超过其他血清型。在确定了AAV3的独特组织嗜性后，大量研究致力于提高rAAV3载体的转导效率，包括通过衣壳修饰优化AAV3载体、增强hHGFR表达以及修饰酪氨酸激酶功能。基于此研究人员构建了一种AAV3载体，包含优化后的hFⅨ cDNA序列。当被包裹在AAV3衣壳中时，该载体在B型血友病患者和“人源化”小鼠体内产生治疗量的hFⅨ，预计它能在较低的病毒剂量下对B型血友病的基因治疗产生较好的效果，而无需免疫抑制。

AAV6

AAV6是在人腺病毒（Ad）样本中发现的，它主要结合唾液酸化的蛋白聚糖，特别是带有α2,3或α2,6连接的唾液酸，作为其主要的受体。它还与硫酸乙酰肝素（HS）结合，表皮生长因子受体（EGFR）是其共受体。在rAAV6的衣壳蛋白上，唯一观察到的PTM是乙酰化。

树突状细胞（DCs）作为抗原呈递细胞（APCs），在调节适应性免疫反应中起着至关重要的作用。已经证明，各种血清型的AAV载体可以成功转导DCs不同亚群，这为开发基于AAV的抗肿瘤疫苗提供了可能性。其中rAAV2/6对单核细胞来源树突状细胞（MoDCs）具有较高组织嗜性，其衣壳内的特定氨基酸变化会影响肝素结合和转导效率，且不影响MoDCs的免疫刺激功能，有望推动rAAV2/6作为疫苗载体的发展。

研究发现，rAAV6在转导人DCs方面更有效。通过优化AAV6载体的衣壳和启动子区域，能显著提高其在MoDCs中的转导效率。另外，使用优化后的AAV6载体转导MoDCs，可以产生了更多具有增强杀伤能力的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），这些CTLs能够更有效地杀伤人前列腺癌细胞（LNCaP），为癌症免疫治疗提供了新的策略。

AAV8

AAV8于2002年在恒河猴中被发现。AAV8与AAV2和AAV3具有相同的主要受体，即LamR。rAAV8的衣壳蛋白会经历磷酸化、糖基化和乙酰化等PTMs。AAV2、AAV5、AAV8和AAV9常被用于转染肝细胞。rAAV8可以通过腹腔、门静脉或外周静脉注射，在灵长类、犬类和啮齿类动物中高效且稳定地转导至肝细胞。研究表明，AAV8递送的目标基因在肝脏中的表达量大约是其他血清型的10-100倍。

蛋白酶体抑制剂（Pi）已被证明在体内外均能显著提高AAV的转导。比如在对极化肺气道上皮的研究表明，三肽蛋白酶抑制剂(LLnL)和AAV2在肺表面共同作用可使肺上皮细胞的表达水平提高200倍以上。然而，在骨骼肌或心肌中并未检测到这种增强作用。Pi增强AAV转导的作用已在不同血清型和细胞类型中得到证实。在一项研究中，研究人员证明AAV7和AAV8在转导内皮细胞时表现出有限的效率，并且抑制蛋白酶体会显著增加转基因表达的水平。这两种情况下，Pi都增强了病毒颗粒的核转位。但这种作用是有选择性的，仅针对血管细胞类型。这一发现表明蛋白酶体降解会阻碍AAV转导，而抑制蛋白酶体活性可以克服这一障碍。

AAV9

AAV9最初在人类样本中被发现，因其具有独特的血清学特性而被归类为一种新血清型。后来的研究表明它与包含AAV7和AAV8的分支密切相关。AAV9的主要受体是N端-半乳糖（terminal N-linked galactose）。此外，AAV9还利用LamR和潜在的整合素作为共受体。rAAV9衣壳表现出广泛的PTMs，包括乙酰化、泛素化、磷酸化、SUMO化和糖基化。在大多数组织中，AAV9相比其他AAV变体展现出更优越的细胞转导能力。在涉及通过AAV1-AAV9全身系统性给药的小鼠模型中，AAV9表现出最快的起效时间、最佳的基因组扩散以及最高的蛋白质表达水平。利用人源化肝脏小鼠模型（表1），研究人员发现AAV9有望成为人肝脏基因递送的可行候选载体。

 

表1 在肝脏特异性基因治疗的临床应用中，不同AAV载体的受体和组织嗜性

（图片来源：Hadi，M.，et al. Virol J，2024）

 

溶瘤病毒

溶瘤病毒（OVs）是一类新型癌症治疗方法，通过诱导免疫原性细胞死亡和激活宿主的抗肿瘤免疫反应促进肿瘤消退。目前，已有四种溶瘤病毒在全球范围内获得批准上市，用于治疗黑色素瘤、鼻咽癌和胶质母细胞瘤等晚期癌症。OVs能够结合传统和现代癌症治疗方法，特别是免疫检查点抑制剂（ICIs）和以T细胞为中心的药物。OVs治疗和基因治疗的成功取决于病毒载体的有效递送和靶组织的精确定位。理想的OVs应充分了解其生物学和遗传学特征，应具有免疫原性，能够在感染的癌细胞中诱导细胞裂解，并且不会引发慢性感染或传染病。此外，它不应具备整合到人类基因组中的能力。例如，通过选择组织特异性启动子，可以更精准地将载体负载的表达基因限制在特定细胞类型中（图2）。目前，相关临床试验已表明，溶瘤AAV疗法导致的不良事件极少，突显出该方法的良好安全性。

 

图2 rAAV转导通路示意图

（图片来源：Hadi，M.，et al. Virol J，2024）

 

AAV3和Trichosanthin在肿瘤治疗中的联合使用

rAAV3载体在体内展现出对肝癌细胞的高效靶向性，当去除衣壳表面暴露的丝氨酸和苏氨酸残基后（S663V+T492V），其转导效率得到增强。这种调整优化了病毒的组织嗜性和与细胞受体结合的能力。有研究人员通过rAAV3基因治疗与紫草素化疗相结合的方式，成功地在肝癌异种移植模型中抑制了肿瘤发展。具体使用剂量为每只小鼠5×10¹⁰ vg rAAV3-S663V+T492V-TCS，并连续五天每天给予1 mg/kg的紫草素，结果发现该组合疗法显著抑制了肿瘤生长，为抗肿瘤干预提供了一种新思路。

2. AAV在HCC基因治疗研究中面临的挑战和优势

基于AAV的基因治疗存在一些局限性，包括由于其相对简单的基因组结构（4.7kb），AAV能携带的外源基因片段有限；以及个体中可能存在针对特定AAV血清型的中和抗体（NAbs）。在肝脏基因治疗中，NAbs会显著降低基因治疗效果，即使低浓度的NAbs。因此，在临床试验中，检测到针对AAV衣壳的NAbs是受试者经常被排除的一个标准。一项针对犬血友病的AAV基因治疗研究中，发现在给予AAV8和AAV9后，被转导的肝细胞中出现了克隆扩增。这些整合事件通常发生在与细胞生长相关的基因附近，会导致某些动物体内凝血因子Ⅷ水平升高。但在该研究中，并无肿瘤产生。值得注意的是，用于临床研究的AAV血清型通常是根据小鼠等临床前动物模型中收集的数据来确定的。然而，根据AAV2、AAV5和AAV8的相关数据发现，AAV的肝脏靶向性可能因物种而异，在小鼠或非人灵长类动物（NHPs）的临床前模型与实际人类患者之间存在显著差异。对接受rAAV治疗的患者进行AAV基因组整合检查，显示在长期随访期间（载体递送后超过12年）是安全的，没有迹象表明存在长期的肝毒性或产生HCC。因此，无论使用哪种载体来递送遗传物质，都必须对患者进行严格监测，以检测任何可能的致癌性整合。此外，应考虑在安全的基因组区域靶向整合位点以确保基因的长期表达。

重要的是，rAAV在基因治疗应用中也极具吸引力。首先，有多种经过验证且可靠的启动子可供选择，这些启动子能有效地驱动转基因的表达。其次，rAAV引起的免疫反应极小，并且它们可以感染静止和活跃分裂的细胞，从而确保持久的遗传改变。这些特性使它们适用于广泛的疾病模型。此外，AAV转导本身安全性较高，并不会引起疾病和副作用。另外，由于多种AAV具有强嗜肝性，因此HCC成为AAV基因治疗的一个重要研究领域（表2）。凭借这种组织嗜性，研究人员可以设计多种创新治疗方法，以应对大多数肝癌患者长期面临的预后不佳等问题。尽管AAV基因疗法在其他疾病治疗中取得了显著进展，但目前尚未有针对HCC的活跃的临床试验。

表2 AAV基因治疗HCC的利与弊

（图片来源：Hadi，M.，et al. Virol J，2024）