劲帆医药拥有自主研发的昆虫杆状病毒One-Bac 4.0系统专利群。One-Bac 4.0系统通过引入AAV表达元件调控新策略,结合关键工艺优化,在利用昆虫系统大规模量产AAV过程中,实现高产率、高活性、高实心率,单批次产能可达1E+18vg!
劲帆医药的⼀站式基因治疗CDMO服务平台,拥有专业且经验丰富的GMP质量控制团队,擅长方法学开发、确认/验证及合规检测,全面保障产品的质量。
以下是我们可提供的质量控制的部分放行检测指标。
类别 | 检测项目 | 检测方法 |
鉴别 | 特征序列鉴别 | 二代测序 |
衣壳蛋白鉴别 | Western Blot、ELISA | |
纯度 | 衣壳蛋白纯度 | SDS-PAGE、CE-SDS |
空壳率 | AUC、TEM、UV | |
聚集度 | DLS、HPLC | |
含量及效价 | 病毒衣壳滴度 | ELISA |
基因组滴度 | ddPCR、qPCR | |
感染滴度 | TCID50 | |
比滴度 | 基因组滴度:感染滴度比例计算 | |
总蛋白 | BCA | |
效价-基因表达 | qPCR、ELISA、Western Blot | |
效价-活性 | 细胞水平、动物水平 | |
杂质 | Sf9宿主细胞蛋白残留 | ELISA |
核酸酶残留 | ELISA | |
Sf9宿主细胞DNA残留 | qPCR | |
杆状病毒DNA残留 | qPCR | |
特定工艺相关残留(如亲和配基、Triton等) | ELISA、HPLC-CAD | |
安全性 | 活性BEV | 嗜斑法、TCID50 |
弹状病毒 | qPCR | |
复制型腺相关病毒 | qPCR | |
螺原体 | qPCR、培养法 | |
支原体 | qPCR、培养法 | |
内毒素 | 凝胶法、光度法 | |
无菌 | 培养法 | |
异常毒性 | 小鼠豚鼠注射实验 | |
其他物化性质 | 外观 | 目视法 |
可见异物 | 灯检法 | |
pH | 电位法 | |
渗透压 | 冰点法 | |
不溶性微粒 | 光阻法 | |
装量检查 | 体积法、重量法 |
One-Bac 4.0系统生产的AAV初产率可达1~5E+15vg/L,不同生产规模下,纯化前后产量稳定,单批次产能可达1E+18vg。
图A:50mL-200L不同生产规模下,批次间AAV的初产率(蓝色)和总初产量(红色)示意图(Lot序号代表同一规模下的不同批次)。AAV初产率在50mL、5L、50L和200L规模下,不同批次间均可稳定在1~5E+15vg/L;AAV总初产量在线性放大(从5L到200L)时,损失较小,不同批次间稳定性好。
图B:5L-200L不同生产规模下,批次间AAV的初产率(蓝色)和纯化后产率(红色)示意图(Lot序号代表同一规模下的不同批次)。在5L、50L和200L生产规模下,纯化后的AAV产率(红色)都能稳定在2~4E+14vg/L。
图C:One-Bac 4.0系统在初产率(蓝色)和纯化后产率(红色)上都明显高于HEK293系统。200L大规模的One-Bac 4.0系统的初产率及纯化后产率依然高出5L小规模的HEK293系统4-5倍,表明了One-Bac 4.0系统高产在线性放大下的可靠性。
One-Bac 4.0系统采用的杆状病毒表达载体(Baculovirus Expression Vector,BEV)在10代以内的传代稳定性高,确保大规模生产时,AAV批次间仍具有高产率和高病毒活性的特征。
图A:BEV连续传代实验显示,用于AAV生产的BEV在P10内的连续传代不影响AAV的包装效率,即P10代内的BEV都能保证单个SF9细胞稳定产出1E+5以上的病毒颗粒,确保批次间产率稳定。图B:SDS-PAGE实验显示,P10代内的BEV表达的AAV病毒VP蛋白产量和比例稳定,VP1:VP2:VP3=1:1:10,在保证批次间产率稳定的同时,保证批次间病毒的活性稳定。
One-Bac 4.0系统收获液中AAV实心率高于70%,终产品中AAV实心率可达94%,略胜于HEK293系统。
One-Bac 4.0系统和HEK293系统收获液和终产品AAV的AUC实心率比较。图A:One-Bac 4.0系统AAV收获液(A1)和终产品(A2)的AUC结果示意图。图B:劲帆HEK293系统AAV收获液(B1)和终产品(B2)的AUC结果示意图。图C:One-Bac 4.0 系统vs 劲帆HEK293系统AAV产品AUC结果比较。亲和层析得到的初级收获液中,One-Bac 4.0的AAV实心率(% full)可达73.58%,明显高于HEK293系统的52.97%;通过亲和与阴离子交换层析后得到的终产物中,One-Bac 4.0的AAV实心率(% full)可达94.32%,与HEK293系统的92.32%相当。这表明One-Bac 4.0系统生产的AAV具有高实心率。
图D:One-Bac 4.0系统(D1)和劲帆HEK293系统(D2)AAV终产物的电镜(TEM)实心率比较。除了“金标准”AUC检测外,常用的TEM检测结果也表明One-Bac 4.0系统包装的AAV终产物具有高实心率,与HEK293系统相当,达到91%。
细胞及动物实验结果表明,One-Bac 4.0 TM系统⽣产的rAAV感染效果媲美甚⾄⾼于HEK293系统。